WO2010010674A1 - フコースα１→６特異的レクチン - Google Patents

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WO2010010674A1
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fucose
sugar chain
lectin
specific lectin
sugar
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PCT/JP2009/003346
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小林夕香
平林淳
館野浩章
河岸洋和
道羅英夫
Original Assignee
株式会社Ｊ－オイルミルズ
独立行政法人産業技術総合研究所
国立大学法人静岡大学
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    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Definitions

  • the present invention relates to a novel fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin, a method for producing the same, and a use thereof, in particular, the novel lectin derived from basidiomycetes or ascomycetes, a method for producing the same, and detection of sugar chains using the lectin and It relates to a classification method.
  • ADCC activity Antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • Natural killer cells, monocytes and other leukocytes are mediated by antibodies such as cancer cells Activity of killing target cells.
  • ADCC activity is related to the anti-tumor mechanism of antibody drugs such as Herceptin (a therapeutic drug for metastatic breast cancer) which is a humanized antibody and Rituxan (a therapeutic drug for non-Hodgkin lymphoma) which is a chimeric antibody (Non-patent Document 1). ).
  • Herceptin a therapeutic drug for metastatic breast cancer
  • Rituxan a therapeutic drug for non-Hodgkin lymphoma
  • the ADCC activity is said to be 50 to 100 times different between an antibody having fucose ⁇ 1 ⁇ 6 transferred and an antibody not transferred (Non-patent Document 2). If an untransferred antibody of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 can be obtained, an antibody drug with high ADCC activity can be provided.
  • fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain examples include, in addition to fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain, glycolipid sugar chain having fucose other than ⁇ 1 ⁇ 6 bond, It also shows affinity for mannose sugar chains.
  • AAL and AOL also have affinity for fucose ⁇ 1 ⁇ 2, fucose ⁇ 1 ⁇ 3, and the like.
  • LCA, PSA and VFA also have affinity for N-linked single and / or double-chain sugar chains that do not have fucose ⁇ 1 ⁇ 6.
  • a lectin that specifically binds only to fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain is not known, and therefore fucose ⁇ 1 ⁇ 6 based on accurate detection of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain and detection of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain.
  • fucose ⁇ 1 ⁇ 6 based on accurate detection of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain and detection of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain.
  • neither purification of sugar chains nor purification of non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains has been realized.
  • an object of the present invention is to provide a novel lectin that specifically binds to fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain, a method for detecting fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain more accurately than before, and fucose ⁇ 1 ⁇
  • An object of the present invention is to provide a method for separating fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains based on detection of 6 sugar chains.
  • the present inventors have discovered a novel lectin having an extremely high affinity with a sugar chain having fucose ⁇ 1 ⁇ 6.
  • fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain was specifically detected, and it was found that this lectin could be used for purification of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain or non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain, and the present invention was achieved.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain means a structure in which fucose is bonded to N-acetylglucosamine at the reducing end of the N-type sugar chain through an ⁇ 1 ⁇ 6 bond.
  • the non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain means a sugar chain having no ⁇ 1 ⁇ 6 linked fucose in the molecule.
  • the present invention is a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin, (1) extracted from basidiomycetes or ascomycetes, (2) has a molecular weight of 4,000 to 40,000 by SDS electrophoresis, and (3) the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific to the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain, having an affinity shown by a binding constant of 1.0 ⁇ 10 4 M ⁇ 1 or more (at 25 ° C.) Provide lectin.
  • the binding constant is a numerical value measured at, for example, an analysis temperature of 25 ° C. using frontal affinity chromatography (FAC method).
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain may have a sialic acid at its non-reducing end.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin is further characterized in that it does not substantially bind to (4) a high mannose sugar chain and / or glycolipid not containing a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin further comprises (5) a binding constant of 1.0 ⁇ 10 4 M ⁇ for one, two, three and / or four sugar chains of fucose ⁇ 1 ⁇ 6N bond type. It is preferably characterized by having an affinity of 1 or more (at 25 ° C.).
  • the basidiomycete belongs to, for example, Moegitakeceae, Kisimeidae, Amanita or Tacokinaceae. *
  • the basidiomycete is, for example, Tsutsugitake, Sugitake, Numerisutaketake, Salmonella, Kuritake, Korasakijiji or Fly agaric. *
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin particularly comprises the amino acid sequence shown in (6) SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also provides (a) a protein or peptide consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5, or (b) one or more amino acids in any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 5.
  • a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin which is a protein or peptide functionally equivalent to a protein or peptide having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5, wherein the amino acid is deleted, inserted or substituted .
  • “functionally equivalent” means that the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain has an affinity represented by a binding constant of 1.0 ⁇ 10 4 M ⁇ 1 or more (at 25 ° C.).
  • the protein or peptide shown in (b) has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, for example.
  • the present invention also provides a protein or peptide having at least 37% homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 6 and having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 6
  • a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin which is a functionally equivalent protein or peptide is provided.
  • the present invention also provides an aqueous medium extract of basidiomycetes and / or ascomycetes, wherein (i) hydrophobic chromatography and reverse phase chromatography, (ii) affinity chromatography, or (iii) ion exchange chromatography and gel
  • hydrophobic chromatography and reverse phase chromatography e.g., hydrophobic chromatography and reverse phase chromatography
  • affinity chromatography e.g., affinity chromatography
  • iii) ion exchange chromatography and gel When subjected to filtration chromatography, (vi) the molecular weight by SDS electrophoresis is 4,000 to 40,000, and (v) the binding constant for fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain is 1.0 ⁇ 10 4 M ⁇ 1 or more (25 A method for producing a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin comprising obtaining a lectin having an affinity shown in FIG.
  • It is preferably selected from at least one of the basidiomycete or Moegiaceae, Kisimeidae, Amanita, and Octopus. *
  • the basidiomycete is at least one selected from tsutsusugitake, sugitake, numerisutaketake, red salmon, chestnut, komura saxi-meji, and fly agaric. *
  • the basidiomycetes and / or ascomycetes used in the process for producing the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin preferably uses fruit bodies.
  • the present invention also provides a method for detecting fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain, which comprises allowing a sugar chain to act on the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin.
  • the sugar chain is, for example, a tumor marker.
  • the present invention also provides a method for fractionating fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains, which comprises allowing sugar chains to act on the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin. That is, the present invention provides a method for separating fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains using fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin as a binding medium for fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains.
  • the sugar chain that acts on the fractionation method is bound to an antibody, for example. *
  • the present invention also provides a diagnostic agent for detecting fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain, containing the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin as an active ingredient, and a diagnostic kit containing the diagnostic agent.
  • the novel lectin of the present invention has an extremely higher affinity than ever for a binding constant of 1.0 ⁇ 10 4 M ⁇ 1 or more for a sugar chain, glycopeptide or glycoprotein having fucose ⁇ 1 ⁇ 6, That is, only a sugar chain having a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain structure can be specifically recognized.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin can be used for various applications as follows.
  • the method for detecting fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain of the present invention more selectively detects a sugar chain to which ⁇ 1 ⁇ 6 fucose is bound. Can do. *
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain fractionation method of the present invention enables more precise fractionation of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain on the basis of accurate identification of ⁇ 1 ⁇ 6 fucose. . Thereby, fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain or non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain can be purified with high purity.
  • the ADCC activity of an antibody drug is reduced by removing the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain from the antibody drug consisting of a mixture of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain. Increase.
  • the antibody drug can be formulated with a smaller dose, and effects such as cost reduction and reduction of side effects are exhibited. It is also possible to prescribe antibody drugs according to symptoms and side effects.
  • FIG. 1 is a structural diagram of ⁇ 1 ⁇ 6 fucose oligosaccharide and non- ⁇ 1 ⁇ 6 fucose oligosaccharide used in Examples and Comparative Examples of the present invention. It is a structural diagram of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 oligosaccharide and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 oligosaccharide used in Examples and Comparative Examples of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a PTL purification process of Example 1.
  • 2 is an elution diagram of ion exchange chromatography of the PTL of Example 1.
  • FIG. 2 is an elution diagram of affinity chromatography of PTL of Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing a purification process of SRL of Example 2.
  • 3 is an elution diagram of hydrophobic chromatography of the SRL of Example 2.
  • FIG. 3 is an elution diagram of reverse phase chromatography of the SRL of Example 2.
  • FIG. 4 is a result of SDS-PAGE of SRL of Example 2 (drawing substitute photograph).
  • FIG. It is a result of the MS spectrum of PTL of Example 1. It is a result of the MS spectrum of SRL of Example 2. It is the result (drawing substitute photograph) of the western blotting using PTL of Example 1.
  • FIG. It is the result (drawing substitute photograph) of the western blotting using SRL of Example 2.
  • FIG. It is the result (drawing substitute photograph) of the western blotting using SRL of Example 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing a purification process of SRL of Example 2.
  • 3 is an elution diagram of hydrophobic chromatography of the SRL of Example 2.
  • FIG. 3 is an elution diagram of reverse phase
  • FIG. 3 is a result of detecting a difference in sugar chain (L1 and L3) of ⁇ -fetoprotein by ELISA using the PTL of Example 1.
  • FIG. 6 is a result of detecting a sugar chain difference (L1 and L3) of ⁇ -fetoprotein by ELISA using the SRL of Example 2.
  • FIG. 5 shows the detection results of the sugar chain difference (L1 and L3) of ⁇ -fetoprotein by ELISA using AAL of Comparative Example 1.
  • FIG. FIG. 6 is a result of detecting a difference in sugar chain (L1 and L3) of ⁇ -fetoprotein by ELISA using AOL of Comparative Example 2.
  • FIG. 6 is a result of detection of a sugar chain difference (L1 and L3) of ⁇ -fetoprotein by ELISA using LCA of Comparative Example 3.
  • FIG. FIG. 4 is a diagram showing the NSL purification process of Example 3.
  • FIG. 4 is an elution diagram of hydrophobic chromatography of NSL of Example 3.
  • FIG. 3 is an elution diagram of reverse phase chromatography of NSL of Example 3. It is a result (drawing substitute photograph) of NSL SDS-PAGE of Example 3.
  • FIG. 4 is a diagram showing a purification process of LSL of Example 4.
  • 4 is an elution diagram of hydrophobic chromatography of LSL of Example 4.
  • FIG. 4 is an elution diagram of reverse phase chromatography of LSL of Example 4.
  • FIG. It is a result (drawing substitute photograph) of SDS-PAGE of LSL of Example 4. It is a result of the MS spectrum of NSL of Example 3. It is a result of the MS spectrum of L
  • Man means mannose
  • GlcNAc means N-acetylglucosamine
  • Fuc means fucose
  • the sugar chain to which fucose is ⁇ 1 ⁇ 6-linked is fluorescently labeled with a free oligosaccharide chain, CyDye, ethyl 4-aminobenzoate (ABEE), aminopyridine, etc., as long as it is an N-linked sugar chain.
  • a free oligosaccharide chain CyDye, ethyl 4-aminobenzoate (ABEE), aminopyridine, etc.
  • the sugar chain is partially decomposed chemically with acid, hydrazine, etc., sialidase, galactositase, N-acetylhexosaminidase, fucosidase, mannosidase, and used simultaneously or stepwise.
  • the sugar chain may be partially decomposed.
  • a sugar such as glucose, a functional group such as an acetyl group, a sulfate group, or a phosphate group may be added to the sugar chain.
  • Basidiomycetes or Ascomycetes which are derived from the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin, belong to, for example, Moegitakeceae, Kisimeidae, Octopusaceae and Amanitaceae.
  • Moegitake family include Tsutsugitake, Salmonella, Kuritake, Sugitake, Numerizugitake, Numerisugitake and the like.
  • xyme family include komula shimeji.
  • Examples of the octopus kinaceae include white bamboo shoots and tsuchuuchitake.
  • Examples of amanita mushrooms include fly agaric.
  • Moegiaceae, Asteraceae, or Amanita are particularly preferred from the viewpoint of lectin fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain recognition specificity and lectin recovery efficiency, and more preferably Tsutsugitake, Sugitake, Numerisugitake Modoki, Salmonella, Kuritake, Komura Saxi-meji or Fly Agaric. *
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin has (2) a molecular weight of 4,000 to 40,000, preferably 4,000 to 20,000, as determined by SDS electrophoresis.
  • the molecular weight by SDS electrophoresis is measured according to the Laemmi method (Nature, 227, 680, 1976), for example.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin has (3) a binding constant for fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain of 1.0 ⁇ 10 4 M ⁇ 1 or more, preferably 1.0 ⁇ 10 5 M ⁇ 1 or more, Preferably, it is 1.0 ⁇ 10 6 M ⁇ 1 or more. That is, the binding constant is significantly higher than AAL, AOL, LCA, NPA and PSA which are conventionally known to have an affinity for fucose ⁇ 1 ⁇ 6. This means that the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin binds to the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain with extremely high selectivity compared to the conventional lectin.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain may have sialic acid at its non-reducing end.
  • Conventional fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectins eg, LCA, NPA and PSA
  • LCA, NPA and PSA have low affinity for fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains having sialic acid at the non-reducing end.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin is superior to the conventional one in that it has a high affinity for such a sugar chain.
  • the method for determining the binding constant by frontal affinity chromatography will be described below.
  • FAC method frontal affinity chromatography
  • Preparation of the lectin column used for this apparatus is performed as follows. 1. The purified lectin is dissolved in 0.1-0.2M NaHCO 3 buffer (pH 8.3-8.5). 2. It is immobilized on a carrier such as NHS activated Sepharose via the primary amino group of the lectin. 3. Block with Tris buffer containing primary amine or ethanolamine. 4. Suspend lectin-sepharose in 10 mM Tris buffer (pH 7.4, TBS) containing 0.8% NaCl, and fill the lectin-immobilized resin into a miniature column ( ⁇ 2 mm x 10 mm, 31.4 ⁇ l). To do. 5). The miniature column filled with the lectin immobilization resin is protected with a holder, and the lectin column is connected to an FAC automatic analyzer (FAC-1, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • FAC automatic analyzer FAC automatic analyzer
  • the elution front (V 0 ) of the sugar chain (PA rhamnose) that does not interact with the lectin is used as a reference, and the elution front (V) delay (V ⁇ V 0 ) of the interacting sugar chain is the interaction strength.
  • the binding constant (K a ) between the sugar chain and the lectin is determined from VV 0 and B t based on the following standard expression of FAC. The higher the interaction strength (VV 0 ) and the binding constant, the higher the affinity between lectin and fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain.
  • A is the substance used for elution
  • a 0 is the initial concentration of substance A
  • B is the immobilized ligand
  • V is the elution volume
  • V 0 is the elution front volume of the substance that does not interact with the immobilized ligand B
  • B t is the amount of effective ligand
  • Kd is the dissociation constant (reciprocal of the binding constant)
  • the sugar-binding specificity of a lectin can also be confirmed by examining the type and concentration of saccharides that can inhibit the agglutination reaction of erythrocytes using erythrocytes that can be specifically aggregated.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin further does not substantially bind to (4) a high mannose sugar chain and / or glycolipid not containing the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin has a higher binding specificity.
  • “substantially does not bind” means that the coupling constant is 1.0 ⁇ 10 3 M ⁇ 1 or less, preferably 1.0 ⁇ 10 2 M ⁇ 1 or less, particularly preferably 0. means.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin further comprises (5) a binding constant of 1.0 ⁇ 10 4 M ⁇ 1 for one, two, three and / or four sugar chains of fucose ⁇ 1 ⁇ 6N bond type.
  • the affinity shown above (at 25 ° C.) is preferable, and the affinity shown by a binding constant of 1.0 ⁇ 10 5 M ⁇ 1 or more is more preferable.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin of the present invention has a common amino acid structure as shown in SEQ ID NO: 1.
  • the fourth, fifth, sixth and seventh Xaas of SEQ ID NO: 1 mean Asp / Asn / Glu / Thr, Thr / Ser / Ala, Tyr / Phe, and Gln / Lys / Glu, respectively, and their diagonal lines Means “or”.
  • fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin of the present invention are the proteins or peptides shown in SEQ ID NOs: 1 to 6. *
  • the lectin shown in SEQ ID NO: 2 is a novel lectin (hereinafter referred to as “PTL”) that can be extracted from Tsutsugitake.
  • the 10th and 17th Xaas of SEQ ID NO: 2 may be any amino acid residue, but are preferably Cys.
  • the 20th, 23rd, 27th, 33th, 35th and 39th Xaas are Tyr / Ser, Phe / Tyr, Arg / Lys / Asn, Asp / Gly / Ser, Asn / Ala, and Thr / Gln, respectively. . *
  • the lectin shown in SEQ ID NO: 3 is a novel lectin (hereinafter referred to as SRL) that can be extracted from salmon bamboo.
  • the 10th and 17th Xaas of SEQ ID NO: 3 may be any amino acid residue, but are preferably Cys.
  • the 4th, 7th, 9th, 13th, 20th, 27th, 29th, 33th, 34th and 39th Xaas are Pro / Gly, Glu / Lys, Val / Asp, Asn / Asp / Glu, His / Ser, Lys, respectively. / His, Val / Ile, Gly / Asn / Ser, Ala / Thr, and Arg / Thr. *
  • the lectin shown in SEQ ID NO: 4 is a novel lectin (hereinafter referred to as “LSL”) that can be extracted from komasakichiji.
  • the 10th and 17th Xaas of SEQ ID NO: 4 may be any amino acid residue, but are preferably Cys. 1st, 4th, 7th, 8th, 9th, 13th, 16th, 20th, 22nd, 25th, 27th, 31st and 34th Xaa are Ala / Gln, Pro / Lys, Ala / Ser, Met / Ile / Val, respectively.
  • the lectin shown in SEQ ID NO: 5 is a novel lectin (hereinafter referred to as “NSL”) that can be extracted from Kuritake.
  • the 10th and 17th Xaa of SEQ ID NO: 5 may be any amino acid residue, but is preferably Cys.
  • the thirteenth, fourteenth and sixteenth Xaas are Asp / Thr, Ser / Ala, and Gln / Lys, respectively. *
  • SEQ ID NO: 6 is also a novel lectin (hereinafter referred to as “NSL”) that can be extracted from Kuritake.
  • SEQ ID NO: 6 is a mutant in which one Asn is inserted into the peptide of SEQ ID NO: 5. Accordingly, the 10th and 18th Xaas of SEQ ID NO: 6 may be any amino acid residue, but is preferably Cys.
  • the 14th, 15th and 17th Xaa are Asp / Thr, Ser / Ala and Gln / Lys, respectively. *
  • the present invention provides (a) a protein or peptide consisting of the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5, or (b) SEQ ID NO: 2 In the amino acid sequence shown in any one of 1 to 5, one or more amino acids are deleted, inserted or substituted, and are functionally equivalent to a protein or peptide having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5 A fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin which is a protein or peptide is provided.
  • “functionally equivalent” means a binding constant of 1.0 ⁇ 10 4 M ⁇ 1 or more, preferably 1.0 ⁇ 10 5 M ⁇ 1 or more, for fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain, Preferably, it means having an affinity of 1.0 ⁇ 10 6 M ⁇ 1 or more.
  • An example of the mutant shown in (b) is the protein or peptide shown in SEQ ID NO: 6.
  • the present invention also provides (a) a protein or peptide consisting of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 2 to 5, or (b) one or more amino acids in any one of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 2 to 5.
  • “functionally equivalent” has the same meaning as described above. *
  • the homology between the proteins or peptides shown in SEQ ID NOs: 2-6 is at least 37% (see Table 14). Accordingly, the present invention provides a protein or peptide having at least 37% homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 6 and having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5. Fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectins that are functionally equivalent proteins or peptides are also provided. Here, “functionally equivalent” has the same meaning as described above. *
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin can be isolated from basidiomycetes and / or ascomycetes by appropriately combining known extraction methods, separation methods, purification methods, and the like.
  • the method includes a step of obtaining an aqueous medium extract of basidiomycetes and / or ascomycetes using an aqueous medium as an extraction solvent. From this extract, (vi) the molecular weight by SDS electrophoresis is 4,000 to 40,000, preferably 4,000 to 20,000, and (v) the binding constant for fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain is 1.
  • a lectin having an affinity of 0.0 ⁇ 10 4 M ⁇ 1 or more, preferably 1.0 ⁇ 10 5 M ⁇ 1 or more, more preferably 1.0 ⁇ 10 6 M ⁇ 1 or more (at 25 ° C.). obtain.
  • the basidiomycete is selected from at least one of Moegiaceae, Kisimeidae, Octopusaceae, and Amanita.
  • Tsuchisugitake Pholiota terrestris Overholts
  • Pholiota squarrosa Pholiota squarrosa (Pholiota squarrosa (Fr.) Kummer)
  • Numerisugitake Pholiota adiposa (Fr.) Kummer
  • stropharia rugosoannulata Stropharia rugosoannulata Farlow in Murr.
  • Hypholoma lateritium Naematoloma sublateritium (Fr.) Karst Or, Hyphoroma sublaterium (Fr.) Quelidae, such as Moegitake, Lepista sordida (Schum .: Fr.) Sing., Etc .; tum), T
  • a method for obtaining an aqueous medium extract from an aqueous medium and fruit bodies such as basidiomycetes is not particularly limited as long as the aqueous medium and fruit bodies such as basidiomycetes can be brought into contact with each other. From the viewpoint of extraction efficiency, a method of pulverizing fruit bodies such as basidiomycetes in an aqueous medium to form a suspension is preferable. Moreover, as a method to grind
  • aqueous medium examples include a buffer solution, a mixture of an organic solvent that can be mixed with water, and water or a buffer solution.
  • a buffer solution or a mixture of an organic solvent and a buffer solution is used.
  • the buffer solution is not particularly limited, and a known buffer solution can be used. Among them, those having a buffer capacity in the range of pH 3 to 10 are preferable, and those having a buffer capacity in the range of pH 6 to 8 are more preferable. Specific examples include a phosphate buffer, a citrate buffer, an acetate buffer, and a Tris buffer. Among these, a phosphate buffer is preferable from the viewpoint of extraction efficiency. *
  • the salt concentration of the buffer solution is not particularly limited, but is preferably 1 to 100 mM, more preferably 5 to 20 mM, from the viewpoint of extraction efficiency and buffer capacity. *
  • the buffer may further contain salts.
  • a phosphate buffered physiological saline in which sodium chloride is further added to a phosphate buffer is preferable as the aqueous medium in the present invention.
  • any organic solvent that can be mixed with water can be used without particular limitation. Of these, acetone, methanol, ethanol, 2-propanol and acetonitrile are preferable.
  • the content of the organic solvent when mixing the organic solvent with water or a buffer is preferably 10 to 40% by mass.
  • the extraction step further includes a step of removing insoluble matter in the aqueous medium from a mixture of the aqueous medium and fruit bodies such as basidiomycetes.
  • the method for removing insoluble materials include filtration, centrifugation, and the like, but centrifugation is preferred from the viewpoint of removal efficiency.
  • the extraction step is particularly preferably a step in which fruit bodies such as basidiomycetes are pulverized in phosphate buffered physiological saline and insolubles are removed by centrifugation to obtain an aqueous medium extract.
  • the production method of the present invention may include a step of dialysis treatment of the fraction containing lectin obtained in the purification step, and a step of lyophilizing the lectin solution after the dialysis treatment. Thereby, a lectin can be isolated easily.
  • the step of dialysis treatment and the step of freeze-drying can be performed by a commonly used known method. *
  • fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin which is a protein or peptide that is substituted and functionally equivalent to the protein or peptide having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 5, is extracted from natural plants. Furthermore, it may be artificially expressed in a host different from the natural origin, or may be chemically synthesized. Such materials are also within the scope of the present invention. Expression and chemical synthesis in the host can be performed by a commonly used known method. *
  • the present invention also provides a method for detecting fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain using the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin recognizes and binds fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains more specifically than before, so that sugars such as polysaccharides, glycolipids and glycoproteins containing fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains Suitable for specific detection of chain compounds.
  • a labeling means is incorporated in the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin used in the detection method.
  • a labeled lectin such a lectin may be referred to as a labeled lectin.
  • the labeled lectin of the present invention includes at least a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin and a labeling means, and is characterized by being detectably labeled.
  • labeling means known labeling methods can be applied without particular limitation, and examples thereof include labeling with a radioisotope, binding of a labeling compound, and the like.
  • the labeling compound is not particularly limited as long as it is usually used for this purpose, and examples thereof include a direct or indirect labeling compound, an enzyme, and a fluorescent compound. Specific examples include biotin, digoxigenin, horseradish-derived peroxidase, fluorescein isothiocyanate, and CyDye. These labeling compounds can be bound to lectins by a conventional method. *
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin is preferably a basidiomycete-derived lectin, particularly preferably PTL, SRL, NSL, LSL, and AML, and more preferably PTL and SRL.
  • PTL and SRL are different from conventional fucose ⁇ 1 ⁇ 6 affinity lectins in that they do not bind to fucose other than fucose ⁇ 1 ⁇ 6 or high mannose sugar chains without fucose. It is optimal as a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin used in the detection method of the invention.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain can be detected, for example, by lectin chromatography using the immobilized fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin.
  • Lectin chromatography is affinity chromatography that utilizes the property that lectins bind specifically to sugar chains. When combined with HPLC (HPLAC), high throughput can be expected.
  • HPLC HPLC
  • gel materials such as agarose, dextran, cellulose, starch and polyacrylamide are generally used.
  • commercially available products can be used without particular limitation, and examples thereof include Sepharose 4B and Sepharose 6B (both manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • the concentration of the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin to be immobilized is usually 0.001 to 100 mg / ml, preferably 0.01 to 20 mg / ml.
  • the carrier is an agarose gel, it is activated with CNBr or the like and then coupled with the lectin.
  • a lectin may be immobilized on a gel into which an activation spacer has been introduced. Further, the lectin may be immobilized on a gel into which a formyl group has been introduced and then reduced with NaCNBH 3 .
  • a commercially available activated gel such as NHS-Sepharose (manufactured by GE Healthcare Bioscience) may also be used.
  • a buffer solution is flowed for the purpose of washing and equilibration.
  • An example of the buffer is a molar concentration of 5 to 500 mM, preferably 10 to 500 mM, a pH of 4.0 to 10.0, preferably 6.0 to 9.0, and a NaCl content of 0 to 0.00.
  • the buffer is 5M, preferably 0.1 to 0.2M, and CaCl 2 , MgCl 2 or MnCl 2 content is 0 to 10 mM, preferably 0 to 5 mM.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain is eluted in a neutral non-denaturing buffer capable of effectively eluting the sugar chain using a desorbing agent such as sodium chloride or hapten sugar.
  • This buffer may be the same as described above.
  • the concentration of the desorbing agent is preferably 1 to 500 mM, particularly preferably 10 to 200 mM.
  • the specimen containing the sugar chain is not particularly limited. Examples thereof include blood, plasma, serum, tears, saliva, body fluid, milk, urine, cell culture supernatant, and secretions from transformed animals. *
  • a specific example of the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain that is the target of the detection method is a sugar chain synthesized by ⁇ 1 ⁇ 6 fucose transferase.
  • Examples of the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain include ⁇ -fetoprotein, ⁇ 5 ⁇ 1 integrin, TGF ⁇ receptor, EGF receptor and the like.
  • the sugar chain that acts on the detection method is preferably a tumor marker.
  • the subject of the detection method of the present invention is prostate cancer, breast cancer, stomach cancer, small intestine cancer, colon cancer, colorectal cancer, renal cell cancer, pancreatic cancer, small cell lung cancer, non-small cell cancer, uterine cancer, Ovarian cancer, thyroid cancer, soft tissue sarcoma, osteosarcoma, melanoma, glioblastoma, astrocytoma, medulloblastoma, acute lymphoma, malignant lymphoma, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's disease, acute myeloid leukemia, chronic lymphocytic leukemia It is expected to be used for diagnosis of cardiovascular disease such as emphysema; *
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin is a novel lectin having biochemical properties such as physicochemical properties and binding specificity to sugar chains, which are different from conventionally known lectins.
  • fucose ⁇ 1 ⁇ 6 bond is specifically recognized, it can be used as a diagnostic agent / test reagent, a specific adsorbent for separation and analysis of carbohydrates, an immunomodulator and the like.
  • the present invention includes a diagnostic agent for detecting fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain synthesized by fucose ⁇ 1 ⁇ 6 transferase, comprising the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin as an active ingredient, and the diagnostic agent.
  • the diagnostic agent or diagnostic agent kit diagnoses the above-mentioned hepatocellular carcinoma and the like. *
  • the present invention also comprises separating fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains using the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin as a binding medium for fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains.
  • a method for fractionating fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains is provided. *
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin used in the method for fractionating fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain is preferably a basidiomycete lectin, particularly preferably PTL, SRL, NSL, LSL and AML, more preferably PTL and SRL. It is. *
  • the fractionation method of the present invention is, for example, lectin chromatography using the immobilized fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin.
  • the details are the same as those described in the detection method.
  • an affinity column is prepared by covalently binding fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin to a column carrier made of agarose or cellulose via a functional group, and passing the sugar chain sample . After passing through the column, the adsorbed fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain is recovered.
  • the sugar chain sample passing without being adsorbed is collected. *
  • the target to be purified by the fractionation method of the present invention can be of two types: fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain.
  • a specific example is a sugar chain bound to an antibody, preferably a sugar chain bound to human IgG. *
  • the purity of the sugar chain separated by the above-described fractionation method that is, in the case of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain, the ratio of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain to the total amount of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain, non-fucose
  • the ratio of non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain to the total amount of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain is usually 90-100%, preferably 95-100 %, Particularly preferably 99 to 100%.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical comprising as an active ingredient a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain or a non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain having a purity of usually 90 to 100%, preferably 95 to 100%, particularly preferably 99 to 100%.
  • a pharmaceutical comprising as an active ingredient a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain or a non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain having a purity of usually 90 to 100%, preferably 95 to 100%, particularly preferably 99 to 100%.
  • an antibody drug consisting of an antibody from which ⁇ 1 ⁇ 6 fucose-transferred antibody has been removed is expected to improve ADCC activity.
  • Candidates include Rituxan (chimeric antibody, NH lymphoma), Herceptin (humanized antibody, breast cancer), Erbitux (chimeric antibody, colon cancer, head and neck cancer), Zevalin (mouse antibody, NH lymphoma), Campath (humanized antibody, B cell chronic lymphocytic leukemia), Bexar (mouse antibody, NH lymphoma), Avastin (humanized antibody, metastatic colorectal cancer) and the like.
  • Rituxan chimeric antibody, NH lymphoma
  • Herceptin humanized antibody, breast cancer
  • Erbitux chimeric antibody, colon cancer, head and neck cancer
  • Zevalin mouse antibody, NH lymphoma
  • Campath humanized antibody, B cell chronic lymphocytic leukemia
  • Bexar mouse antibody, NH lymphoma
  • Avastin humanized antibody, metastatic colorectal cancer
  • the method for using the antibody drug obtained by the fractionation method of the present invention has a higher specific activity than conventional ones. It is the same as the ordinary method except that it can be suppressed.
  • the present invention also provides a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain or non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain having a purity of 90 to 100% and fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain having a purity of 90 to 100%, which is separated by the above-described fractionation method.
  • a pharmaceutical comprising a non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain as an active ingredient.
  • the purity means the ratio of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain to the total amount of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain, and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6.
  • sugar chains it means the ratio of non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains to the total amount of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains.
  • the medicament is preferably an antibody medicament. *
  • the present invention also provides a screening method for fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains.
  • This method comprises reacting the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin with a fluid containing a sugar chain, and recovering the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain adsorbed on the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin.
  • This screening method is useful for searching for a novel tumor marker having fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain.
  • a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin that can be used in the detection method of the present invention, a disease marker containing fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain can be easily screened.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin used in the screening method is preferably a basidiomycete-derived lectin, particularly preferably selected from at least one of Moegiaceae, Kisimeidae, Octopusaceae and Amanita, more preferably PTL, SRL, NSL, LSL, and / or AML. Of these, PTL and SRL are most preferred. *
  • the present invention also provides a screening method for fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain-specific lectin.
  • the immobilized fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin is used.
  • a fluid containing a plurality of sugar chains is allowed to act on the immobilized specimen lectin, and the fluid is applied to the test profile (gel electrophoresis, etc.) of the sugar chains adsorbed on the immobilized lectin and the immobilized PTL or SRL. Act.
  • fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin having the same profile as the control is extracted.
  • the target lectin can be screened by a very simple operation.
  • the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin thus extracted may be used as a control for the next screening method.
  • the sugar chain includes at least one fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain as shown in FIGS. 1 and 2, and further contains at least one non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain to which fucose other than ⁇ 1 ⁇ 6 bond is transferred, and fucose. It is preferable that at least one kind of sugar chain (for example, a high mannose sugar chain) is contained. By adding these, it can be confirmed that the sugar chains other than the fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain have no affinity. *
  • SDS-polyacrylamide electrophoresis SDS-polyacrylamide electrophoresis using Phassystem (manufactured by GE Healthcare Bioscience) as the electrophoresis apparatus and Gradient8-25 (manufactured by GE Healthcare Bioscience) as the gel. The sample was subjected to electrophoresis. Electrophoresis was performed according to the product protocol and routine using 1 ⁇ l of both sample solution and molecular weight marker.
  • FIG. 6 shows the results of SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS-PAGE) of PTL. Lane M and lanes 1 and 2 in FIG. 6 are as follows.
  • Lane M Molecular weight marker (APRO), Lane 1: PTL reducing agent (-), Lane 2: PTL reducing agent (+), Gel: Gradient 8-25, Sample: 1 ⁇ l / lane, Stain: Coomassie brilliant blue (CBB)
  • Hydrophobic Chromatography Hydrophobic Chromatography purification was performed by subjecting the above salmonella 80% ammonium sulfate precipitation fraction to butyl-Toyopearl 650M (manufactured by Tosoh Corporation) equilibrated with 2M ammonium sulfate-PBS. In this chromatography, the pure water elution fractions were combined, dialyzed and freeze-dried to obtain a crude salmon lectin lectin fraction ( ⁇ ⁇ part in FIG. 8). *
  • FIG. 10 shows the result of SDS-PAGE of SRL.
  • Lane M and lanes 1 and 2 in FIG. 10 are as follows. Lane M: molecular weight marker (manufactured by APRO), lane 1: SRL reducing agent (+), lane 2: SRL reducing agent ( ⁇ ), Gel: Gradient 8-25, Sample: 1 ⁇ l / lane, Stain: silver
  • Comparative Example 1 AAL (Seikagaku Biobusiness Co., Ltd.-J-Oil Mills)
  • Comparative Example 2 AOL (Tokyo) Kasei Kogyo Co., Ltd.-manufactured by Laurel Wreath Co., Ltd.
  • Comparative Example 3 LCA (Seikagaku Biobusiness Co., Ltd.-J-Oil Mills Co., Ltd.)
  • Comparative Example 4 PSA (Biochemical Biobusiness ( The above-mentioned sugar-binding specificity was evaluated using (Co., Ltd.-J-Oil Mills). The results are shown in Tables 2 and 3. *
  • Tables 2 and 3 show the following.
  • the PTL of Example 1 and the SRL of Example 2 bound only to thyroglobulin having fucose ⁇ 1 ⁇ 6.
  • AAL of Comparative Example 1 bound to mannose, fucose and fructose in saccharides and to mucin having fucose in an O-linked sugar chain in glycoproteins.
  • the AOL of Comparative Example 2 bound to mannose, fucose and fructose in the saccharide, and bound to mucin having fucose in the O-linked sugar chain in the glycoprotein.
  • the LCA of Comparative Example 3 and the PSA of Comparative Example 4 bound to mannose and methyl ⁇ -mannoside as sugars. It can be said that the PTL of Example 1 and the SRL of Example 2 are fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectins that do not bind to fucose or mannose but bind only to fucose ⁇ 1 ⁇ 6 bond.
  • PA sugar chains were purchased from Takara Bio Inc., Biochemical Biobusiness Co., Ltd., and Masuda Chemical Industry Co., Ltd.
  • unlabeled sugar chains and sugar chains obtained by enzymatic digestion of sugar chains were pyridylaminated with GlycoTAG (registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.).
  • GlycoTAG registered trademark, manufactured by Takara Bio Inc.
  • Frontal affinity chromatography was performed using an FAC automatic analyzer (FAC-1, manufactured by Shimadzu Corporation). Specifically, the lectin column prepared above was inserted into a stainless steel holder and connected to the FAC-1 apparatus. The flow rate and column temperature were kept at 0.125 ml / min and 25 ° C., respectively. After equilibrating the miniature column with the TBS, an excessive volume (0.5 ml to 4 ml) of a PA sugar chain (3.75 nM or 7.5 nM) was continuously injected into the column using an automatic sampling device. *
  • the fluorescence intensity (excitation wavelength: 310 nm and fluorescence wavelength: 380 nm) of the eluate of PA sugar chain was monitored, and the interaction intensity [difference in front eluate with respect to standard oligosaccharide (PA rhamnose): VV 0 ] was measured. .
  • the binding constant Ka was determined from the interaction strength and the effective ligand amount. The results are shown in Tables 4-9.
  • the AAL of Comparative Example 1 and the AOL of Comparative Example 2 are glycolipids that are non- ⁇ 1 ⁇ 6 together with fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains (sugar chains No. 15, 201-203, 401-418).
  • the fucose sugar chain (sugar chains No. 718, 722, 723, 727, 909, 910, 933) of the system is also bound.
  • many sugar chains (sugar chains No. 003 and 005-014) having no fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain are also bound.
  • the PTL of Example 1 and the SRL of Example 2 surely bind fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains and do not bind non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains or sugar chains without fucose at all. .
  • glycoprotein having an N-type sugar chain having fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain the following formula: With thyroglobulin (pig).
  • glycoprotein having an N-type sugar chain not having fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain the following formula: ⁇ 1-acid glycoprotein (human) having
  • Biotinylation of lectin The lectin was weighed and dissolved by adding a 0.1 M sodium bicarbonate solution (concentration: 5 mg / ml). The biotinylation reagent was dissolved in dimethyl sulfoxide and added to the lectin solution for reaction. The reaction product was dialyzed and freeze-dried to obtain biotin-labeled lectin. *
  • FIGS. 13 to 17 are photographs of the following glycoproteins stained with PTL (FIG. 13), SRL (FIG. 14), AAL (FIG. 15), AOL (FIG. 16), or LCA (FIG. 17). *
  • lanes 0 to 6 are as follows. Lane 1: thyroglobulin, lane 2: lactoferrin, lane 3: immunoimmunoglobulin, lane 4: transferrin, lane 5: ⁇ 1-acid glycoprotein, lane 6: invertase, lane 0: serum albumin (control)
  • lanes M and 1 to 6 are as follows. Lane M: molecular weight marker, lane 1: thyroglobulin, lane 2: lactoferrin, lane 3: immunoimmunoglobulin, lane 4: transferrin, lane 5: ⁇ 1-acid glycoprotein, lane 6: invertase, lane 0: serum albumin
  • the LCA of Comparative Example 3 also detects a glycoprotein (invertase) having high mannose as well as a glycoprotein having fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain.
  • a glycoprotein having fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain In contrast, in the PTL of Example 1 and the SRL of Example 2, only glycoproteins having fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains are detected, and non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains and sugar chains having no fucose are completely detected. I can say no. *
  • the reaction was stopped with 1M phosphoric acid, and the absorbance at 450 nm was measured with a microplate reader (MPR-A4i, manufactured by Tosoh Corporation). From this value, the reaction value ([absorbance at 450 nm] ⁇ [value of the well reacted with the glycoprotein not immobilized on the plate]) was calculated. Next, for each lectin, the interaction strength (relative value) for each glycoprotein was calculated with the value of glycoprotein (thyroglobulin) taken as 100%. The calculation results are shown in Table 9 and FIGS. *
  • the AAL of Comparative Example 1 and the AOL of Comparative Example 2 also detect an O-type sugar chain (mucin) containing fucose as well as a glycoprotein having fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain.
  • O-type sugar chain molecular weight
  • the PTL of Example 1 and the SRL of Example 2 only the glycoprotein having fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain is detected, and the non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain and the sugar chain not having fucose are not detected. .
  • the lectins of Comparative Examples 1 to 3 have inferior interaction strengths with lactoferrin and immunoglobulins compared to thyroglobulin, whereas the lectins of Examples 1 and 2 have less interaction strengths with lactoferrin and immunoglobulins. Equivalent to thyroglobulin. *
  • AFP Tumor Marker Sugar Chain by ELISA Method
  • ⁇ -fetoprotein (hereinafter referred to as AFP) is a glycoprotein contained in serum having an N-linked sugar chain and hardly exists in healthy adult serum.
  • ⁇ -fetoprotein-L1 sugar chain (AFP-L1) is increased in patients with benign liver disease, and ⁇ -fetoprotein-L3 sugar chain (AFP-L3) is further detected in patients with liver cancer.
  • the difference in sugar chain is measured using LCA, and the measurement result is used as a diagnosis of liver disease. *
  • ⁇ -fetoprotein derived from human umbilical cord serum, mainly L1-type sugar chain
  • ⁇ -fetoprotein-L3 derived from culture supernatant of human liver cancer cells
  • the PTL of Example 1 and the SRL of Example 2 detect changes in the sugar chain of the tumor marker ( ⁇ -fetoprotein-L1 type sugar chain and L3 type sugar chain) at least equal to the LCA of Comparative Example 3. I understand that I can do it. From this, it can utilize for the diagnostic agent or diagnostic agent kit which consists of making PTL of Example 1 and SRL of Example 2 act on a sugar_chain
  • the target fucose 1 ⁇ 6 sugar chain compound may be detected more accurately than other lectins from a group of sugar chain compounds other than fucose 1 ⁇ 6 sugar chains. Is expensive. *
  • FIG. 32 shows the result of NSL SDS-PAGE. Lanes 1 and 2 in the figure are as follows. Lane M: molecular weight marker, lane 1: NSL ⁇ -ME (+), lane 2: NSL ⁇ -ME ( ⁇ ), Gel: Gradient 10-15 (GE Healthcare Bioscience), Sample: 1 ⁇ l / lane, Stain: silver
  • ammonium sulfate precipitation About 1.5 kg of ammonium sulfate was added to 1.5 L of the extract so that the ammonium sulfate concentration was saturated to 80% and stirred. After confirming complete dissolution, the solution was allowed to stand at 7 ° C. overnight. This solution was centrifuged (10,000 rpm, 20 min, 4 ° C.), a small amount of pure water was added to the precipitate and suspended, and a 80% ammonium sulfate precipitate fraction was collected. The collected 80% ammonium sulfate sulfate precipitated fraction was dialyzed against pure water using a dialysis membrane (fraction 6,000 to 8,000). *
  • FIG. 36 shows the result of SDS-PAGE of LSL.
  • lane M and lane 1 are as follows.
  • Lane M molecular weight marker
  • lane 1 LSL (hydrophobic chromatography, reverse phase): ⁇ -ME (+)
  • Gel Gradient 10-15 (GE Healthcare Bioscience)
  • Sample 1 ⁇ l / lane
  • Stain silver
  • the NSL of Example 3 and the LSL of Example 4 detect only fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains, and do not detect any non-fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chains or sugar chains having no fucose. Furthermore, it also strongly binds to the triple or quadruple fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain. In addition, even when sialic acid is added, the binding constant of fucose ⁇ 1 ⁇ 6 sugar chain does not decrease. *
  • Table 14 shows the calculation results of homology between the proteins or peptides shown in SEQ ID NOs: 2 to 6. From this result, it can be seen that a fucose ⁇ 1 ⁇ 6 specific lectin can be obtained if it has at least 37% homology with the amino acid sequence shown in any of sequences 2 to 6.

Abstract

【課題】フコースα１→６糖鎖に特異的に結合する新規レクチンとその用途を提供する。【解決手段】本発明のフコースα１→６特異的レクチンは、（１）担子菌又は子嚢菌から抽出され、（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００～４０，０００であり、及び、（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ－１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを特徴とする。これを用いれば、フコースα１→６糖鎖を特異的に検出し、また、フコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖の精製に有効である。

Description

フコースα１→６特異的レクチン
本発明は、新規なフコースα１→６特異的レクチン、その製造方法及びその用途に関し、特に担子菌又は子嚢菌由来の新規な前記レクチン、その製造方法、並びに該レクチンを用いた糖鎖の検出及び分別方法に関する。
Ｎ結合型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにフコースα１→６を転移させるフコースα１→６転移酵素（α１→６ＦｕｃＴ）の遺伝子は、肝細胞の癌化にともなって発現することが知られている。この癌化した肝細胞は、現在、フコースに親和性をもつレンズマメレクチン（ＬＣＡ）を用いたレクチン親和電気泳動によって検出されている。　
抗体依存性細胞障害活性（Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、以下、ＡＤＣＣ活性という）は、ヒトが持っている免疫機能のひとつであり、ナチュラルキラー細胞、単球等の白血球が抗体を介して癌細胞等の標的細胞を殺傷する活性である。ＡＤＣＣ活性は、ヒト化抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（転移性乳癌の治療薬）、キメラ抗体であるＲｉｔｕｘａｎ（非ホジキンリンパ腫の治療薬）等の抗体医薬の抗腫瘍メカニズムと関連している（非特許文献１）。これらの抗体医薬のＡＤＣＣ活性が低いと、抗体医薬の多量投与の必要が生じ、それに起因して、コストアップ、副作用、例えば免疫低下による感染症等の問題を招く。　
上記ＡＤＣＣ活性は、フコースα１→６の転移した抗体と転移していない抗体とで５０～１００倍の差があるといわれている（非特許文献２）。フコースα１→６の転移していない抗体を取得できれば、ＡＤＣＣ活性の高い抗体医薬を提供することが可能となる。　
従来、フコースα１→６と親和性を有するレクチンとして、上記ＬＣＡの他にも、エンドウマメレクチン（ＰＳＡ）、ヒイロチャワンタケレクチン（ＡＡＬ）、ラッパスイセンレクチン（ＮＰＡ）、ソラマメレクチン（ＶＦＡ）、麹菌レクチン（ＡＯＬ）等が知られている（特許文献１～５）。　　
Ｃｌｙｎｅｓ　ＲＡ等、Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆｃ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｍｏｄｕｌａｔｅ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｕｍｏｒ　ｔａｒｇｅｔｓ．　ＮＡＴＵＲＥ　ＭＥＤ　２０００　ＡＰＲ；６（４）：４４３－４４６ Ｔｏｙｏｈｉｄｅ　Ｓｈｉｎｋａｗａ等、Ｔｈｅ　ａｂｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｆｕｃｏｓｅ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｅｎｃｅ　ｏｆ　ｇａｌａｃｔｏｓｅ　ｏｒ　ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ　Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ１　ｃｏｍｐｌｅｘ－ｔｙｐｅ　ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｓｈｏｗｓ　ｔｈｅ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｅｎｈａｎｃｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２００３　Ｊａｎ　３１；　２７８（５）：３４６６－７３．　Ｅｐｕｂ　２００２　Ｎｏｖ　８． ＷＯ２００２／０３０９５４ ＷＯ２００３／０８４５６９ 特開平０２－０８３３３７の実施例 特開２００２－１１２７８６の実施例５ 特開２００７－１６１６３３
フコースα１→６糖鎖の検出に利用されている公知のレクチンは、フコースα１→６糖鎖の他にも、α１→６結合以外のフコースを持つ糖脂質系糖鎖や、フコースを持たないハイマンノース糖鎖にも親和性を示す。具体的には、ＡＡＬやＡＯＬは、フコースα１→２、フコースα１→３等にも親和性を有する。ＬＣＡ、ＰＳＡ及びＶＦＡは、フコースα１→６をもたないＮ結合型一本及び／又は二本鎖糖鎖にも親和性を有する。フコースα１→６糖鎖とのみ特異的に結合するレクチンは知られておらず、したがって、フコースα１→６糖鎖の正確な検出やフコースα１→６糖鎖の検出を基準とするフコースα１→６糖鎖の精製や非フコースα１→６糖鎖の精製も実現できていないのが現状である。　
そこで、本発明の目的は、フコースα１→６糖鎖に特異的に結合する新規レクチンを提供し、それを用いてフコースα１→６糖鎖を従来よりも正確に検出する方法、及びフコースα１→６糖鎖の検出を基準としたフコースα１→６糖鎖と非フコースα１→６糖鎖との分別方法を提供することにある。　
本発明者等は、フコースα１→６を有する糖鎖との親和性が極めて高い新規なレクチンを発見した。それを用いればフコースα１→６糖鎖を特異的に検出し、また、このレクチンをフコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖の精製に活かせることを見出し、本発明に到達した。ここで、フコースα１→６糖鎖とは、Ｎ型糖鎖の還元末端のＮ－アセチルグルコサミンにα１→６結合でフコースが結合した構造を意味する。また、非フコースα１→６糖鎖とは、α１→６結合フコースを分子中に持たない糖鎖を意味する。　
すなわち、本発明は、フコースα１→６特異的レクチンであって、（１）担子菌又は子嚢菌から抽出され、（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００～４０，０００であり、及び、（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ－１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを特徴とする、前記フコースα１→６特異的レクチンを提供する。前記結合定数とは、本明細書において、例えばフロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ法）を用い、分析温度２５℃において測定される数値である。　
前記フコースα１→６糖鎖は、その非還元末端にシアル酸を有するものであってもよい。　
前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに、（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことを特徴とすることが好ましい。　
前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに、（５）フコースα１→６Ｎ結合型の一本、二本、三本及び／又は四本糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ－１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを特徴とすることが好ましい。　
前記担子菌は、例えばモエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属する。　
前記担子菌は、例えばツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。　
前記フコースα１→６特異的レクチンは、特に（６）配列番号１に示すアミノ酸配列を含む。　
本発明は、また、（ａ）配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンを提供する。ここで、「機能的に同等」とは、フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ－１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを意味する。　
前記（ｂ）に示すタンパク質又はペプチドは、例えば配列番号６に示すアミノ酸配列を有する。　
本発明は、また、配列番号２～６のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも３７％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２～６のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンを提供する。　
本発明は、また、担子菌及び／又は子嚢菌の水系媒体抽出物を、（i）疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー、（ii）アフィニティクロマトグラフィー、又は、（iii）イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーにかけて、（vi）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００～４０，０００、及び、（v）フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０４Ｍ－１以上（２５℃において）で示される親和性を有するレクチンを得ることからなるフコースα１→６特異的レクチンの製造方法を提供する。　
前記担子菌又は、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科及びタコウキン科の少なくとも一種から選ばれることが好ましい。　
前記担子菌は、ツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ及びベニテングタケから選ばれる少なくとも一種であることが好ましい。　
前記フコースα１→６特異的レクチンの製造方法に用いる担子菌及び／又は子嚢菌は、子実体を用いることが好ましい。　
本発明は、また、前記フコースα１→６特異的レクチンに糖鎖を作用させることからなる、フコースα１→６糖鎖の検出方法を提供する。　
前記糖鎖は、例えば腫瘍マーカーである。　
本発明は、また、前記フコースα１→６特異的レクチンに糖鎖を作用させることからなる、フコースα１→６糖鎖の分別方法を提供する。すなわち、フコースα１→６特異的レクチンをフコースα１→６糖鎖の結合媒体として用いて、フコースα１→６糖鎖と非フコースα１→６糖鎖とを分別する方法を提供する。　
前記分別方法に作用させる糖鎖は、例えば抗体に結合したものである。　
本発明は、また、上記フコースα１→６特異的レクチンを有効成分とする、フコースα１→６糖鎖を検出するための診断薬、及び該診断薬を含む診断薬キットを提供する。　
本発明の新規なレクチンは、フコースα１→６を有する糖鎖、糖ペプチドや糖タンパク質に対して結合定数１．０×１０４Ｍ－１以上という、従来よりも極めて高い親和性を有し、すなわち、フコースα１→６糖鎖構造を有する糖鎖のみを特異的に認識することができる。この特異性を利用して、前記フコースα１→６特異的レクチンは以下のような多種の用途へ利用可能である。　
本発明のフコースα１→６糖鎖の検出方法は、フコースα１→６糖鎖との親和性を有する従来のレクチンと違って、α１→６フコースの結合した糖鎖をより選択的に検出することができる。　
本発明のフコースα１→６糖鎖の分別方法は、α１→６フコースの正確な識別を基準として、フコースα１→６糖鎖と非フコースα１→６糖鎖とのより厳密な分別を可能にする。これにより、フコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖を高純度に精製することができる。特に、本発明の分別方法を用いて、フコースα１→６糖鎖と非フコースα１→６糖鎖との混合物からなる抗体医薬からフコースα１→６糖鎖を取り除くことで、抗体医薬のＡＤＣＣ活性を高める。その結果、抗体医薬をより少ない用量で処方可能とし、コストダウン、副作用の低減等の効果を発揮する。また、症状や副作用に応じた抗体医薬の処方も可能になる。
本発明の実施例及び比較例に使用するα１→６フコースオリゴ糖及び非α１→６フコースオリゴ糖の構造図である。 本発明の実施例及び比較例に使用するフコースα１→６オリゴ糖及び非フコースα１→６オリゴ糖の構造図である。 実施例１のＰＴＬの精製工程を示す図である。 実施例１のＰＴＬのイオン交換クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例１のＰＴＬのアフィニティクロマトグラフィーの溶出図である。 実施例１のＰＴＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果（図面代用写真）である。 実施例２のＳＲＬの精製工程を示す図である。 実施例２のＳＲＬの疎水クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例２のＳＲＬの逆相クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例２のＳＲＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果（図面代用写真）である。 実施例１のＰＴＬのＭＳスペクトルの結果である。 実施例２のＳＲＬのＭＳスペクトルの結果である。 実施例１のＰＴＬを用いたウェスタンブロッティングの結果（図面代用写真）である。 実施例２のＳＲＬを用いたウェスタンブロッティングの結果（図面代用写真）である。 比較例１のＡＡＬを用いたウェスタンブロッティングの結果（図面代用写真）である。 比較例２のＡＯＬを用いたウェスタンブロッティングの結果（図面代用写真）である。 比較例３のＬＣＡを用いたウェスタンブロッティングの結果（図面代用写真）である。 コントロールとしてＣＢＢでタンパク質のみを染色した結果（図面代用写真）である。 実施例１のＰＴＬを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。 実施例２のＳＲＬを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。 比較例１のＡＡＬを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。 比較例２のＡＯＬを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。 比較例３のＬＣＡを用いたＥＬＩＳＡによる糖タンパク質検出の結果である。 実施例１のＰＴＬを用いたＥＬＩＳＡによるα－フェトプロテインの糖鎖の違い（Ｌ１とＬ３）の検出結果である。 実施例２のＳＲＬを用いたＥＬＩＳＡによるα－フェトプロテインの糖鎖の違い（Ｌ１とＬ３）の検出結果である。 比較例１のＡＡＬを用いたＥＬＩＳＡによるα－フェトプロテインの糖鎖の違い（Ｌ１とＬ３）の検出結果である。 比較例２のＡＯＬを用いたＥＬＩＳＡによるα－フェトプロテインの糖鎖の違い（Ｌ１とＬ３）の検出結果である。 比較例３のＬＣＡを用いたＥＬＩＳＡによるα－フェトプロテインの糖鎖の違い（Ｌ１とＬ３）の検出結果である。 実施例３のＮＳＬの精製工程を示す図である。 実施例３のＮＳＬの疎水クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例３のＮＳＬの逆相クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例３のＮＳＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果（図面代用写真）である。 実施例４のＬＳＬの精製工程を示す図である。 実施例４のＬＳＬの疎水クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例４のＬＳＬの逆相クロマトグラフィーの溶出図である。 実施例４のＬＳＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果（図面代用写真）である。 実施例３のＮＳＬのＭＳスペクトルの結果である。 実施例４のＬＳＬのＭＳスペクトルの結果である。
前記フコースα１→６特異的レクチンが結合するフコースα１→６糖鎖の例を、以下に示す。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 〔式中、Ｍａｎはマンノース、ＧｌｃＮＡｃはＮ－アセチルグルコサミン、Ｆｕｃはフコースを意味する〕　
フコースがα１→６結合する糖鎖は、上記以外にも、Ｎ結合型糖鎖であれば、遊離のオリゴ糖鎖、CyDye、4-アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）、アミノピリジン等で蛍光標識された糖鎖、糖アミノ酸、糖ペプチド、糖脂質、糖タンパク質、プロテオグリカン、細胞等のすべてを含有する。Ｎ結合型糖鎖は、高マンノース型、複合型、混成型等を含む。さらに、酸、ヒドラジン等で化学的に前記糖鎖を部分的に分解したもの、シアリダーゼ、ガラクシトターゼ、Ｎ－アセチルヘキソサミニダーゼ、フコシダーゼ、マンノシダーゼのいずれかの酵素で、同時にあるいは段階的に使用して、前記糖鎖を部分的に分解したものであってもよい。また、グルコースのような糖、アセチル基、硫酸基、リン酸基のような官能基等を前記糖鎖に付加したものであってもよい。　
前記フコースα１→６特異的レクチンの由来となる（１）担子菌又は子嚢菌は、例えばモエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科に属する。モエギタケ科としては、ツチスギタケ、サケツバタケ、クリタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、ヌメリスギタケ等が挙げられる。キシメジ科としては、コムラサキシメジ等が挙げられる。タコウキン科としては、シロハカワラタケ、ツヤウチワタケ等が挙げられる。テングタケ科としては、ベニテングタケ等が挙げられる。これらの担子菌又は子嚢菌のうち、レクチンのフコースα１→６糖鎖認識特異性とレクチンの回収効率の観点から、モエギタケ科、キシメジ科又はテングタケ科が特に好ましく、さらに好ましくはツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケである。　
前記フコースα１→６特異的レクチンは、（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００～４０，０００であり、好ましくは４，０００～２０，０００である。ここで、ＳＤＳ電気泳動法による分子量は、例えばＬａｅｍｍｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０頁，１９７６年）に準じて測定されるものである。　
前記フコースα１→６特異的レクチンは、（３）フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０４Ｍ－１以上であり、好ましくは１．０×１０５Ｍ－１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ－１以上である。すなわち、フコースα１→６に親和性を有することが従来知られているＡＡＬ、ＡＯＬ、ＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡと比べて、結合定数が著しく高い。これは、前記フコースα１→６特異的レクチンが、従来のレクチンと比べて極めて高い選択性をもってフコースα１→６糖鎖と結合することを意味する。　
フコースα１→６糖鎖は、その非還元末端にシアル酸を有していてもよい。従来のフコースα１→６特異的レクチン（例えばＬＣＡ、ＮＰＡ及びＰＳＡ）は、非還元末端にシアル酸を有するフコースα１→６糖鎖に対して親和性が低かった。一方、前記フコースα１→６特異的レクチンは、このような糖鎖に対しても高い親和性を有する点でも従来のものより優れる。　
フロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ法）による結合定数の求め方を、以下に説明する。この方法は、レクチンを固定化したカラムに、蛍光標識した糖鎖（例えば図１及び２に示すもの）の一定濃度の希釈液を流した際、レクチンと糖鎖とが相互作用がなければ糖鎖は短時間でカラムから流れ出、溶出前端（フロント）が即座に観察され、一方、レクチンとの親和性がある場合、糖鎖の溶出が遅れるという原理に基づく。　
該装置に使用するレクチンカラムの調製は、以下のようにして行われる。１．精製レクチンを０．１～０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ　８．３～８．５）に溶解する。　２．レクチンの一級アミノ基を介してＮＨＳ活性化セファロース等の担体に固定化する。　３．一級アミンを含むトリス緩衝液やエタノールアミン等でブロッキングする。　４．０．８％　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ　７．４、ＴＢＳ）中にレクチン－セファロースを懸濁させ、レクチン固定化樹脂を、ミニチュアカラム（φ２ｍｍ　ｘ　１０ｍｍ，　３１．４μｌ）に充填する。　５．レクチン固定化樹脂を充填したミニチュアカラムをホルダーで保護し、レクチンカラムをＦＡＣ自動分析装置（ＦＡＣ－１、（株）島津製作所製）に接続する。　
平衡化したレクチンカラムに対し、分析用緩衝液（０．８％　ＮａＣｌを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ　７．４））でレクチンが持つ解離定数（Ｋｄ）よりも充分低い濃度（２．５ｎＭ）に希釈したピリジルアミノ化糖鎖（ＰＡ化糖鎖）を、流速０．１２５ｍｌ／ｍｉｎで３００μｌ注入する。カラムからのＰＡ化糖鎖の溶出を、蛍光検出器（励起波長／蛍光波長：３１０ｎｍ／３８０ｎｍ）を用いて検出する。　
検出データから、レクチンと相互作用しない糖鎖（ＰＡ化ラムノース）の溶出前端（Ｖ０）を基準とし、相互作用する糖鎖の溶出前端（Ｖ）の遅れ（Ｖ－Ｖ０）を相互作用強度として算出する。さらに、ＦＡＣの以下の基準式に基づいて、Ｖ－Ｖ０及びＢｔから糖鎖とレクチンとの結合定数（Ｋａ）を求める。上記相互作用強度（Ｖ－Ｖ０）や結合定数が大きいほど、レクチンとフコースα１→６糖鎖との親和性が高い。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
 〔式中、Ａは溶出に用いる物質、Ａ０は物質Ａの初濃度、Ｂは固定化リガンド、Ｖは溶出容量、Ｖ０は固定化リガンドＢと全く相互作用しない物質の溶出前端容量、Ｂｔは有効リガンド量、Ｋｄは解離定数（結合定数の逆数）を意味する〕。　
レクチンの糖結合特異性は、当該レクチンが特異的に凝集させることができる赤血球を用いて、その赤血球の凝集反応を阻止しうる糖類の種類とその濃度を調べることにより確認することもできる。　
前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことが好ましい。これにより、前記フコースα１→６特異的レクチンは、より一層高い結合特異性を有する。本明細書において、「実質的に結合しない」とは、結合定数が１．０×１０３Ｍ－１以下、好ましくは１．０×１０２Ｍ－１以下、特に好ましくは０であることを意味する。　
前記フコースα１→６特異的レクチンは、さらに（５）フコースα１→６Ｎ結合型の一本、二本、三本及び／又は四本糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ－１以上（２５℃において）で示される親和性を有することが好ましく、より好ましくは結合定数１．０×１０５Ｍ－１以上で示される親和性を有する。　
本発明のレクチンと親和性を有するフコースα１→６Ｎ結合型の二本、三本及び／又は四本糖鎖の構造の例を、以下に示す。　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
本発明のフコースα１→６特異的レクチンは、特に配列番号１に示すような共通のアミノ酸構造を有する。配列番号１の第４、５、６及び７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ａｓｎ／Ｇｌｕ／Ｔｈｒ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓ／Ｇｌｕを意味し、その斜線は「又は」を意味する。　
本発明のフコースα１→６特異的レクチンの具体例は、配列番号１～６に示すタンパク質又はペプチドである。　
配列番号２に示すレクチンは、ツチスギタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、ＰＴＬという）である。配列番号２の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第２０、２３、２７、３３、３５及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｔｙｒ／Ｓｅｒ、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ／Ｓｅｒ、Ａｓｎ／Ａｌａ、及び、Ｔｈｒ／Ｇｌｎである。　
配列番号３に示すレクチンは、サケツバタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、ＳＲＬという）である。配列番号３の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第４、７、９、１３、２０、２７、２９、３３、３４及び３９番目のＸａａは、それぞれ、Ｐｒｏ／Ｇｌｙ、Ｇｌｕ／Ｌｙｓ、Ｖａｌ／Ａｓｐ、Ａｓｎ／Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ／Ｓｅｒ、Ｌｙｓ／Ｈｉｓ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ｇｌｙ／Ａｓｎ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、及び、Ａｒｇ／Ｔｈｒである。　
配列番号４に示すレクチンは、コムラサキシメジから抽
出することのできる新規なレクチン（以下、「ＬＳＬ」という）である。配列番号４の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１、４、７、８、９、１３、１６、２０、２２、２５、２７、３１及び３４番目のＸａａは、それぞれ、Ａｌａ／Ｇｌｎ、Ｐｒｏ／Ｌｙｓ、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｍｅｔ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｔｙｒ／Ｔｈｒ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｙｓ／Ｇｌｕ、Ａｌａ／Ａｓｎ、Ｖａｌ／Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ａｓｎ、Ｇｌｎ／Ａｒｇ、及び、Ｔｈｒ／Ｖａｌである。　
配列番号５に示すレクチンは、クリタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、「ＮＳＬ」という）である。配列番号５の第１０及び１７番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１３、１４及び１６番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓである。　
配列番号６に示すレクチンもまた、クリタケから抽出することのできる新規なレクチン（以下、「ＮＳＬ」という）である。配列番号６は、配列番号５のペプチド中に１個のＡｓｎが挿入された変異体である。したがって、配列番号６の第１０及び１８番目のＸａａは、任意のアミノ酸残基であってよいが、好ましくはＣｙｓである。第１４、１５及び１７番目のＸａａは、それぞれ、Ａｓｐ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、及び、Ｇｌｎ／Ｌｙｓである。　
配列番号２～６に示すタンパク質又はペプチドが新規であることから、本発明は、（ａ）配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンを提供する。ここで、「機能的に同等」とは、フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ－１以上であり、好ましくは１．０×１０５Ｍ－１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ－１以上で示される親和性を有することを意味する。（ｂ）に示す変異体の例が、配列番号６に示すタンパク質又はペプチドである。　
本発明は、また、（ａ）配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドをコードする遺伝子を提供する。ここで、「機能的に同等」とは、前記と同じ意味である。　
配列番号２～６に示すタンパク質又はペプチド間の相同性は、少なくとも３７％である(表１４参照)。したがって、本発明は、配列番号２～６のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも３７％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンもまた提供する。ここで「機能的に同等」とは、前記と同じ意味である。　
前記フコースα１→６特異的レクチンは、担子菌及び／又は子嚢菌から、公知の抽出方法、分離方法、精製方法等を適宜組み合わせることにより、単離することができる。例えば、水系媒体を抽出溶媒として用いて、担子菌及び／又は子嚢菌の水系媒体抽出物を得る工程を含む。この前記抽出物から、（vi）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００～４０，０００、好ましくは４，０００～２０，０００、及び、（v）フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０４Ｍ－１以上、好ましくは１．０×１０５Ｍ－１以上、さらに好ましくは１．０×１０６Ｍ－１以上（２５℃において）で示される親和性を有するレクチンを得る。　
前記担子菌は、モエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科の少なくとも一種から選ばれることが好ましい。特に、ツチスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ　Ｏｖｅｒｈｏｌｔｓ）、スギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ　ｓｑｕａｒｒｏｓａ　（Ｆｒ．）　Ｋｕｍｍｅｒ）、ヌメリスギタケ（Ｐｈｏｌｉｏｔａ　ａｄｉｐｏｓａ　（Ｆｒ．）　Ｋｕｍｍｅｒ）、サケツバタケ（Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ　ｒｕｇｏｓｏａｎｎｕｌａｔａ　Ｆａｒｌｏｗ　ｉｎ　Ｍｕｒｒ．）、クリタケ（Ｎａｅｍａｔｏｌｏｍａ　ｓｕｂｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ　（Ｆｒ．）　Ｋａｒｓｔ又はＨｙｐｈｏｌｏｍａ　ｓｕｂｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ（Ｆｒ．）Ｑｕｅｌ）等のモエギタケ科、コムラサキシメジ（Ｌｅｐｉｓｔａ　ｓｏｒｄｉｄａ　（Ｓｃｈｕｍ．　：　Ｆｒ．）　Ｓｉｎｇ．）等のキシメジ科、シロハカワラタケ（Ｔｒｉｃｈａｐｔｕｍ　ｅｌｏｎｇａｔｕｍ）、ツヤウチワタケ（Ｍｉｃｒｏｐｏｒｕｓ　ｖｅｒｎｉｃｉｐｅｓ）等のタコウキン科、ベニテングタケ（Ａｍａｎｉｔａ　ｍｕｓｃａｒｉａ）等のテングタケ科に属するものが好ましい。これらの担子菌及び／又は子嚢菌の使用部位は、子実体であることが好ましい。　
水系媒体と担子菌等の子実体とから、水系媒体抽出物を得る方法については、水系媒体と担子菌等の子実体とを接触させることができれば特に制限はない。抽出効率の観点から、水系媒体中で担子菌等の子実体を粉砕して懸濁液とする方法が好ましい。また、粉砕する方法としては、ミキサー、ホモジナイザー等を用いた通常の粉砕方法を挙げることができる。　
上記水系媒体としては、緩衝液、水と混合し得る有機溶媒と水又は緩衝液との混合物等を挙げることができる。好ましくは、緩衝液又は有機溶媒と緩衝液との混合物を用いる。　
上記緩衝液としては、特に制限されることなく公知の緩衝液を用いることができる。中でも、ｐＨ　３～１０の範囲に緩衝能を有するものが好ましく、ｐＨ　６～８の範囲に緩衝能を有するものがより好ましい。具体的には、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液等を挙げることができる。中でも、抽出効率の観点から、リン酸緩衝液が好ましい。　
前記緩衝液の塩濃度は、特に制限はないが、抽出効率と緩衝能の点から、１～１００ｍＭであることが好ましく、５～２０ｍＭであることがより好ましい。　
前記緩衝液は、さらに塩類を含むことができる。例えば、リン酸緩衝液に食塩を更に加えたリン酸緩衝化生理食塩水等は、本発明における水系媒体として好ましい。　
前記有機溶媒としては、水と混合し得る有機溶媒であれば特に制限なく用いることができる。中でも、アセトン、メタノール、エタノール、２－プロパノール及びアセトニトリルが好ましい。有機溶媒と水又は緩衝液とを混合する場合の有機溶媒の含有量としては、１０～４０質量％であることが好ましい。　
前記抽出工程は、水系媒体と担子菌等の子実体との混合物から、水系媒体に対する不溶物を除去する工程を更に含むことが好ましい。不溶物の除去方法としては、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができるが、除去効率の観点から遠心分離が好ましい。　
前記抽出工程は、リン酸緩衝化生理食塩水中で、担子菌等の子実体を粉砕し、遠心分離によって不溶物を除去して水系媒体抽出物を得る工程であることが特に好ましい。　
前記フコースα１→６特異的レクチンの製造方法では、以下のいずれかの精製手段を採用すると、一層効率的な精製が可能となる。　
（精製方法１）　上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、得られたレクチン画分を疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーで精製する。　
（精製方法２）　上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、チログロブリンをアガロース等に固定した担体を用いたアフィニティクロマトグラフィーに供して精製する。　
（精製方法３）　上記工程によって得られた水系媒体抽出物を、硫酸アンモニウム沈殿法にかけることによってレクチン含有画分を得て、透析凍結乾燥を行った後、粗レクチン画分をトリス緩衝液に溶解後、イオン交換クロマトグラフィーに供し、得られた活性画分を濃縮後、ゲルろ過クロマトグラフィーで分離する。　
本発明の製造方法は、前記精製工程で得られたレクチンを含む画分を透析処理する工程と、透析処理後のレクチン溶液を凍結乾燥する工程とを含んでもよい。これにより、レクチンを容易に単離することができる。透析処理する工程及び凍結乾燥する工程は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。　
（ａ）配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチンは、天然植物からの抽出のほかに、天然由来とは異なる宿主内で人工的に発現させ、又は化学合成させてもよい。そのような物質もまた、本発明の技術的範囲に属する。宿主内での発現や化学合成は、通常用いられる公知の方法によって行うことができる。　
本発明は、また、前記フコースα１→６特異的レクチンを用いたフコースα１→６糖鎖の検出方法を提供する。前記フコースα１→６特異的レクチンは、フコースα１→６糖鎖を従来よりも特異的に認識して結合できることから、フコースα１→６糖鎖を含有する多糖類、糖脂質、糖タンパク質等の糖鎖化合物の特異的検出に好適である。　
前記検出方法に用いる前記フコースα１→６特異的レクチンには、標識手段が組み込まれていることが好ましい。このようなレクチンを以下、標識レクチンということがある。本発明の標識レクチンは、フコースα１→６特異的レクチンと標識手段とを少なくとも含み、検出可能に標識化されていることを特徴とする。　
前記標識手段としては、特に制限なく公知の標識化方法を適用することができ、例えば、放射性同位元素による標識化、標識化合物の結合等を挙げることができる。　
前記標識化合物としては、この用途に通常用いられるものであれば特に制限なく適用することができ、例えば、直接又は間接標識化合物、酵素、蛍光化合物等を挙げることができる。具体的には、ビオチン、ジゴキシゲニン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、フルオレセインイソチオシアネート、ＣｙＤｙｅ等を挙げることができる。これらの標識化合物は、常法によりレクチンと結合することができる。　
前記フコースα１→６特異的レクチンは、好ましくは担子菌由来のレクチンであり、特に好ましくはＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ、ＬＳＬ、及び、ＡＭＬであり、さらに好ましくはＰＴＬ、及び、ＳＲＬである。ＰＴＬ及びＳＲＬは、実施例に示すように、従来のフコースα１→６親和性レクチンと相違して、フコースα１→６以外のフコースや、フコースを持たない高マンノース糖鎖と結合しない点で、本発明の検出方法に使用するフコースα１→６特異的レクチンとして最適である。　
フコースα１→６糖鎖の検出は、例えば固定化された前記フコースα１→６特異的レクチンを用いるレクチンクロマトグラフィーによって行うことができる。レクチンクロマトグラフィーは、レクチンが糖鎖と特異的に結合する性質を利用したアフィニティクロマトグラフィーである。ＨＰＬＣと組み合わせる（ＨＰＬＡＣ）と、ハイスループットを期待することができる。　
フコースα１→６特異的レクチンを固定化
する担体としては、アガロース、デキストラン、セルロース、スターチ、ポリアクリルアミド等のゲル材が一般的である。これらには、市販のものを特に制限なく使用でき、例えばセファロース４Ｂやセファロース６Ｂ（共にＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）が挙げられる。　
レクチンクロマトグラフィーに用いるカラムとしては、マイクロプレートやナノウエルにレクチンを固定化したものも含まれる。　
固定化するフコースα１→６特異的レクチンの濃度は、通常、０．００１～１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１～２０ｍｇ／ｍｌである。担体がアガロースゲルの場合、それをＣＮＢｒ等で活性化してからレクチンとカップリングさせる。活性化スペーサーを導入したゲルにレクチンを固定化してもよい。さらには、ホルミル基を導入したゲルにレクチンを固定化してからＮａＣＮＢＨ３で還元してもよい。また、ＮＨＳ－セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）のような市販の活性化ゲルを使用してもよい。　
フコースα１→６糖鎖試料をカラムにかけた後、洗浄と平衡化の目的で緩衝液を流す。緩衝液の一例は、モル濃度が５～５００ｍＭ、好ましくは１０～５００ｍＭであり、ｐＨが４．０～１０．０、好ましくは６．０～９．０であり、ＮａＣｌ含量が０～０．５Ｍ、好ましくは０．１～０．２Ｍであり、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、又は、ＭｎＣｌ２含量が０～１０ｍＭ、好ましくは０～５ｍＭの緩衝液である。　
アフィニティカラムの洗浄後、フコースα１→６糖鎖の溶出は、該糖鎖を有効に溶出できる中性の非変性緩衝液中で、塩化ナトリウム、ハプテン糖等の脱着剤を用いて行われる。この緩衝液は、上記と同様であってもよい。脱着剤の濃度は、好ましくは、１～５００ｍＭ、特に好ましくは１０～２００ｍＭ濃度である。　
糖鎖の検出には、上記以外のクロマトグラフィー、レクチンチップ、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、凝集法、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等の表面プラズモン共鳴法、電気泳動等も、当業者に周知の方法で使用することができる。　
前記糖鎖を含む検体は、特に限定されない。例えば、血液、血漿、血清、涙、唾液、体液、乳汁、尿、細胞の培養上清、形質転換動物からの分泌物等が挙げられる。　
前記検出方法の対象であるフコースα１→６糖鎖の具体例は、α１→６フコース転移酵素により合成される糖鎖である。該フコースα１→６糖鎖には、αフェトプロテイン、α５β１インテグリン、ＴＧＦβ受容体、ＥＧＦ受容体等が挙げられる。検出方法に作用させる糖鎖は、腫瘍マーカーが好ましい。　
フコースα１→６の転移したαフェトプロテインの確度の高い検出は、臨床的に肝硬変に合併する肝細胞癌の早期診断、肝細胞癌の緻密な経過観察、治療効果の正確な判定、胎児性腫瘍の早期発見、劇症肝炎の肝再生の指標等として有用である。フコースα１→６の転移したα５β１インテグリンもまた、肝癌診断の指標として期待される。　
本発明の検出方法の対象は、肝細胞癌以外に、前立腺癌、乳癌、胃癌、小腸癌、大腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、膵癌、小細胞肺癌、非小細胞癌、子宮癌、卵巣癌、甲状腺癌、軟部肉腫、骨肉腫、メラノーマ、膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、急性リンパ腫、悪性リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病等の腫瘍；アレルギー疾患；自己免疫疾患；並びに肺気腫等の循環器疾患の診断に使用することが期待される。　
前記フコースα１→６特異的レクチンは、物理化学的性質、糖鎖への結合特異性等の生化学的性質が従来公知のレクチンと異なる新規のレクチンである。特にフコースα１→６結合を特異的に認識することから、診断薬・検査試薬、糖質の分離分析用特異的吸着剤、免疫調節剤等として用いることができる。したがって、本発明は、前記フコースα１→６特異的レクチンを有効成分とする、フコースα１→６転移酵素により合成されるフコースα１→６糖鎖を検出するための診断薬、及び該診断薬を含む診断薬キットを提供する。前記診断薬又は診断薬キットは、上記の肝細胞癌等を診断する。　
本発明は、また、前記フコースα１→６特異的レクチンをフコースα１→６糖鎖の結合媒体として用いて、フコースα１→６糖鎖と非フコースα１→６糖鎖とを分別することからなる、フコースα１→６糖鎖の分別方法を提供する。　
前記フコースα１→６糖鎖の分別方法に用いるフコースα１→６特異的レクチンは、担子菌レクチンが好ましく、特に好ましくはＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ、ＬＳＬ、及び、ＡＭＬであり、さらに好ましくはＰＴＬ及びＳＲＬである。　
本発明の分別方法は、例えば固定化された前記フコースα１→６特異的レクチンを用いるレクチンクロマトグラフィーである。その詳細は、前記検出方法で説明したものと同様である。フコースα１→６糖鎖の精製を行なう場合、フコースα１→６特異的レクチンを、アガロースやセルロースからなるカラム担体に官能基を介して共有結合させて親和性カラムを調製し、糖鎖試料を通す。通塔後、吸着したフコースα１→６糖鎖を回収する。非フコースα１→６糖鎖の精製を行う場合には、上記カラムに糖鎖試料を通塔する際、吸着しないで通過する糖鎖試料を回収する。　
本発明の分別方法により精製される対象は、フコースα１→６糖鎖、非フコースα１→６糖鎖の二種類があり得る。その具体例は、抗体に結合した糖鎖、好ましくはヒトＩｇＧに結合した糖鎖である。　
前記分別方法で分別された糖鎖の純度、すなわちフコースα１→６糖鎖の場合にフコースα１→６糖鎖及び非フコースα１→６糖鎖の総量に対するフコースα１→６糖鎖の比率、非フコースα１→６糖鎖の場合にフコースα１→６糖鎖及び非フコースα１→６糖鎖の総量に対する非フコースα１→６糖鎖の比率は、通常、９０～１００％であり、好ましくは９５～１００％、特に好ましくは９９～１００％である。　
本発明は、前記純度が通常９０～１００％、好ましくは９５～１００％、特に好ましくは９９～１００％のフコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖を有効成分とする医薬もまた提供する。特に、α１→６フコースの転移した抗体の除去された抗体からなる抗体医薬は、ＡＤＣＣ活性の向上が期待される。その候補として、Ｒｉｔｕｘａｎ（キメラ抗体、ＮＨリンパ腫）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（ヒト化抗体、乳癌）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（キメラ抗体、大腸癌、頭頸部癌）、Ｚｅｖａｌｉｎ（マウス抗体、ＮＨリンパ腫）、Ｃａｍｐａｔｈ（ヒト化抗体、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病）、Ｂｅｘｘａｒ（マウス抗体、ＮＨリンパ腫）、Ａｖａｓｔｉｎ（ヒト化抗体、転移性大腸癌）等が挙げられる。　
本発明の分別方法により得られる抗体医薬の使用方法（薬理上許容される担体、助剤・添加剤、投与経路、投与形態等）は、従来のものよりも高い比活性のため用法・用量を抑えてよいこと以外は、常法と同様である。　
本発明は、また、前記分別方法で分別された、純度９０～１００％のフコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖、ならびに該純度９０～１００％のフコースα１→６糖鎖又は非フコースα１→６糖鎖を有効成分とする医薬を提供する。ここで、前記純度は、フコースα１→６糖鎖の場合、フコースα１→６糖鎖及び非フコースα１→６糖鎖の総量に対するフコースα１→６糖鎖の比率を意味し、非フコースα１→６糖鎖の場合、フコースα１→６糖鎖及び非フコースα１→６糖鎖の総量に対する非フコースα１→６糖鎖の比率を意味する。該医薬は、抗体医薬であることが好ましい。　
本発明は、また、フコースα１→６糖鎖のスクリーニング方法を提供する。この方法は、前記フコースα１→６特異的レクチンに糖鎖を含む流体を作用させ、該フコースα１→６特異的レクチンに吸着されたフコースα１→６糖鎖を回収することからなる。前記このスクリーニング方法は、フコースα１→６糖鎖をもつ新規な腫瘍マーカー等の探索に有用である。本発明の検出方法に使用可能なフコースα１→６特異的レクチンを利用して、フコースα１→６糖鎖を含む疾病マーカーを容易にスクリーニングすることもできる。　
前記スクリーニング方法に用いるフコースα１→６特異的レクチンは、好ましくは担子菌由来のレクチンであり、特に好ましくはモエギタケ科、キシメジ科、タコウキン科及びテングタケ科の少なくとも一種から選ばれ、さらに好ましくはＰＴＬ、ＳＲＬ、ＮＳＬ、ＬＳＬ、及び／又は、ＡＭＬである。中でも、ＰＴＬ及びＳＲＬが最も好ましい。　
本発明は、また、フコースα１→６糖鎖特異的レクチンのスクリーニング方法を提供する。この方法には、例えば固定化された前記フコースα１→６特異的レクチンを用いる。固定化された検体レクチンに、複数の糖鎖を含む流体を作用させ、該固定化レクチンに吸着された糖鎖の試験プロファイル（ゲル電気泳動等）と、固定化されたＰＴＬ又はＳＲＬに前記流体を作用させる。該レクチンに吸着される糖鎖の対照プロファイルとを比較して、対照と同じプロファイルになるフコースα１→６特異的レクチンを抽出する。検体レクチンに吸着された糖鎖の同定を区々行う必要がないので、目的のレクチンを非常に簡易な操作でスクリーニングすることができる。こうして抽出されたフコースα１→６特異的レクチンを、次回のスクリーニング方法の対照に用いてもよい。別法として、配列番号１に示すアミノ酸配列の一部又は全部をコードするｃＤＮＡをプライマーに用いて、検体レクチンの中からフコースα１→６特異的レクチンのｃＤＮＡを釣り上げることも可能である。　
上記糖鎖は、図１及び２に示すようなフコースα１→６糖鎖の少なくとも一種を含み、さらにα１→６結合以外のフコースの転移した非フコースα１→６糖鎖の少なくとも一種、及びフコースをもたない糖鎖（例えば高マンノース糖鎖）の少なくとも一種を含むことが好ましい。これらの添加により、フコースα１→６糖鎖以外の糖鎖とは親和性を有さないことの確認がとれる。　
吸着された糖鎖のプロファイル測定には、各種のクロマトグラフィー、質量分析、ゲル電気泳動、レクチンチップ、酵素免疫測定（ＥＬＩＳＡ）法、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システム等の表面プラズモン共鳴法、電気泳動等も、当業者に周知の方法を使用することができる。
以下に、実施例及び比較例を用いて本発明をより詳細に説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。　
〔実施例１及び２〕（ＰＴＬ及びＳＲＬの製造、物性測定、並びに特性評価）（１）ＰＴＬ（実施例１）の製造　　図３に示す精製工程に従って、ツチスギタケからツチスギタケレクチン（ＰＴＬ）を単離精製した。　
（抽出）　　ツチスギタケ約７．５ｇを凍結乾燥して得られたツチスギタケ凍結乾燥粉末２．５ｇに、１０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ　７．２）５０ｍｌを加えて、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目の抽出液を得た。この抽出残渣に、１０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ　７．２）を５０ｍｌ加えて、４℃下で一晩抽出した。この液を遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目の抽出液を得た。これらの抽出液を合わせてろ紙でろ過し、ツチスギタケ抽出液とした。　
（イオン交換クロマトグラフィー）　　上記抽出液８７ｍｌを、１０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ　７．２）で平衡化したＤＥＡＥ－セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に供した。同緩衝液でカラムを洗浄後、０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ　７．２）で溶出した。赤血球凝集活性を示す画分（図４の←→部）を合一し、限外ろ過で脱塩後凍結乾燥した。　
（アフィニティクロマトグラフィー）　　上記凍結乾燥粉末を、１０ｍ
Ｍ　リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ　７．４、以後、ＰＢＳと略す）で溶解し、同緩衝液で平衡化したチログロブリン固定化アガロースに供した。ＰＢＳでカラムを洗浄後、０．２Ｍ　アンモニアで溶出した。赤血球凝集活性を示す画分（図５の←→部）を合一し、限外ろ過で純水に置換後凍結乾燥し、ＰＴＬを１．０７ｍｇ得た。　
（ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動）　　電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＧｒａｄｉｅｎｔ８－２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液及び分子量マーカーを共に１μｌ使用し、電気泳動を製品プロトコール及び常法に従って行なった。図６は、ＰＴＬのＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）の結果である。図６のレーンＭ、レーン１及び２は、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー（ＡＰＲＯ社）、レーン１：ＰＴＬ　還元剤（－）、レーン２：ＰＴＬ　還元剤（＋）、Ｇｅｌ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ８－２５、Ｓａｍｐｌｅ：１μｌ／Ｌａｎｅ、Ｓｔａｉｎ：クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）　
上記の８－２５％　ゲルを用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、主成分がＰＴＬであることを確認した。　
（２）ＳＲＬ（実施例２）の製造　　図７に示す精製工程に従って、サケツバタケからサケツバダケレクチン（ＳＲＬ）を単離精製した。　
（抽出）　　サケツバタケ約４００ｇを凍結乾燥して得られたサケツバタケ凍結乾燥粉末４０ｇに、１．６ＬのＰＢＳを加え、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目抽出液を得た。この抽出残渣にＰＢＳ　０．８Ｌを加え、４℃下で一晩抽出した。この液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目抽出液を得た。これらの抽出液をあわせてサケツバタケ抽出液とした。　
（硫酸アンモニウム沈殿）　　上記抽出液２．４Ｌに対して、硫酸アンモニウム濃度が８０％飽和になるように硫酸アンモニウム１．３ｋｇを添加して攪拌した。完全に溶解したことを確認した後、７℃下で一晩静置した。この溶液を遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）し、沈殿に純水を少量添加し、懸濁してサケツバタケ８０％　硫酸アンモニウム沈殿画分を回収した。　
（疎水クロマトグラフィー）　　上記サケツバタケ８０％　硫酸アンモニウム沈殿画分を、２Ｍ　硫酸アンモニウム－ＰＢＳで平衡化したブチル－トヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に供して、疎水クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、純水溶出画分を合一し、透析及び凍結乾燥を行い、サケツバタケレクチン粗画分を得た（図８の←→部）。　
（逆相クロマトグラフィー）　　上記サケツバタケレクチン粗画分を、０．０５％　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）－０％　アセトニトリルで平衡化したＣ８カラム（和光純薬（株）製）に供して、逆相クロマトグラフィーで精製した。このクロマトグラフィーにおいて、０．０５％　ＴＦＡ－３０％　アセトニトリル溶出画分（図９の←→部）を合一し、常温エバポレートにより溶媒を除去して得られた乾燥粉末を合一して、ＳＲＬを７．５ｍｇ得た。　
電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＧｒａｄｉｅｎｔ８－２５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液及び分子量マーカーを共に１μｌ使用し、電気泳動を製品プロトコール及び常法に従って行なった。図１０は、ＳＲＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。図１０のレーンＭ、レーン１及び２は、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー（ＡＰＲＯ社製）、レーン１：ＳＲＬ　還元剤（＋）、レーン２：ＳＲＬ　還元剤（－）、Ｇｅｌ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ８－２５、Ｓａｍｐｌｅ：１μｌ／Ｌａｎｅ、Ｓｔａｉｎ：ｓｉｌｖｅｒ　
上記の８－２５％　ゲルを用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、主成分がＳＲＬであることを確認した。　
（３）ＰＴＬ及びＳＲＬの物性測定（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析）　　実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬ　１０μｇを、別々に、ＴＡ（０．１％　ＴＦＡとアセトニトリルの体積比２：１の混合物）に溶解した。ＴＡに溶解した飽和マトリックスとレクチンのＴＡ溶液を体積比４：１で混合したもの１．０μｌをターゲットプレートに滴下してサンプルを調製した。質量分析装置としてＡｕｔｏｆｌｅｘ（ブルカーダルトニクス社製）を用い、ＬＰモードでＰＴＬ及びＳＲＬの分子量を測定した。その結果、分子量は約４，５００であった（図１１及び１２）。　
（アミノ酸配列解析）　　実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬのアミノ酸配列を、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ＰＰＳＱ－２１　Ｓｙｓｔｅｍ（（株）島津製作所製）を用いて解析した。その結果を、それぞれ、配列番号２及び３に示す。いずれの配列も新規であった。　
ＰＴＬ及びＳＲＬに対して、ウサギ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヒト（Ａ，Ｂ，Ｏ）、及びアクチナーゼＥ処理ウサギの赤血球凝集活性試験を行った。その結果を、赤血球凝集活性として表１に示す。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 ＮＴ；　ｎｏｔ　ｔｅｓｔｅｄ　
上記のアミノ酸構造解析及び赤血球凝集活性試験の結果から、実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬは、新規なレクチンであることが確認された。　
（４）ＰＴＬ及びＳＲＬの糖結合特異性の評価　　表２に示す種々の単糖、オリゴ糖及び多糖、並びに表３に示す糖タンパク質を用いた赤血球凝集反応阻害試験により、実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬの糖結合特異性を評価した。　
９６穴Ｕ底マイクロタイタープレートに１０μｌの単糖、オリゴ糖、多糖及び糖タンパク質溶液の２倍希釈系列を作製した。力価４にあらかじめ調節しておいたレクチン溶液をそれぞれの穴に１０μｌずつ加えた。室温にて１時間静置して感作させた後、１０μｌの４％赤血球懸濁液をそれぞれの穴に加え、さらに室温にて１時間静置した。その後、赤血球の凝集を完全に阻害するサンプル溶液の希釈倍率を肉眼にて判定した。阻害を示す最低濃度を最小阻害濃度とした。この最小阻害濃度が小さいほど、レクチンに対する特異性が高いことを示している。結果を表２及び３に示す。　
比較のために、フコース特異的レクチンといわれている以下の市販のレクチン：比較例１：ＡＡＬ（生化学バイオビジネス（株）－（株）Ｊ－オイルミルズ製）、比較例２：ＡＯＬ（東京化成工業（株）－月桂冠（株）製）、比較例３：ＬＣＡ（生化学バイオビジネス（株）－（株）Ｊ－オイルミルズ製）、及び、比較例４：ＰＳＡ（生化学バイオビジネス（株）－（株）Ｊ－オイルミルズ製）を用いて、上記糖結合特異性を評価した。結果を表２及び３に併記する。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
表２及び３から以下のことがわかる。実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬは、フコースα１→６を有するチログロブリンにのみ結合した。一方、比較例１のＡＡＬは、チログロブリンのほかに、糖類ではマンノース、フコース及びフルクトースとも結合し、そして糖タンパク質ではＯ結合型糖鎖中にフコースを有するムチンとも結合した。比較例２のＡＯＬは、糖類ではマンノース、フコース及びフルクトースと結合し、そして糖タンパク質ではＯ結合型糖鎖中にフコースを有するムチンと結合した。また、比較例３のＬＣＡ及び比較例４のＰＳＡは、チログロブリンのほかに、糖類ではマンノースやメチルα－マンノシドとも結合した。実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬは、フコースやマンノースに結合せずに、フコースα１→６結合にのみ結合するフコースα１→６特異的レクチンであるといえる。　
（５）ＰＴＬ及びＳＲＬのフコースα１→６糖鎖への結合定数の測定　　実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬのフコースα１→６糖鎖への結合定数を以下の手順で測定した。　
（オリゴ糖の準備）　　図１及び２に示すピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖を測定試験に使用した。ＰＡ化糖鎖は、タカラバイオ（株）、生化学バイオビジネス（株）及び増田化学工業（株）から購入した。もしくは、未標識の糖鎖や糖鎖を酵素消化して得た糖鎖等をＧｌｙｃｏＴＡＧ（登録商標、タカラバイオ（株）製）でピリジルアミノ化した。　
（レクチンカラムの調製）　　０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ　８．３）中にレクチンを溶解し、ＮＨＳ－活性化セファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）の製造者マニュアルに従って結合させた。０．８％　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ　７．４、ＴＢＳ）中にレクチン－セファロースを懸濁させ、ミニチュアカラム（φ２ｍｍ　ｘ　１０ｍｍ，　３１．４μｌ）に充填した。　
（フロンタルアフィニティクロマトグラフィー）　　ＦＡＣ自動分析装置（ＦＡＣ－１、（株）島津製作所製）を用いてフロンタルアフィニティクロマトグラフィーを行った。詳細には、上記で調製したレクチンカラムを、ステンレスホルダーに差し込み、ＦＡＣ－１装置に接続した。流速及びカラム温度を、それぞれ０．１２５ｍｌ／ｍｉｎ及び２５℃に保った。前記ＴＢＳでミニチュアカラムを平衡後、過剰容積（０．５ｍｌ～４ｍｌ）のＰＡ化糖鎖（３．７５ｎＭ、又は、７．５ｎＭ）を、自動サンプリング装置を用いてカラム中へ連続注入した。　
ＰＡ化糖鎖の溶出液の蛍光強度（励起波長３１０ｎｍ及び蛍光波長３８０ｎｍ）をモニターし、相互作用強度〔標準オリゴ糖（ＰＡ化ラムノース）に対する前端溶出液の差：Ｖ－Ｖ０〕を測定した。相互作用強度及び有効リガンド量から結合定数Ｋａを求めた。その結果を、表４～９に示す。　
比較のために、フコース特異的レクチンといわれているＡＡＬ（比較例１）、ＡＯＬ（比較例２）、ＬＣＡ（比較例３）及びＰＳＡ（比較例４）についても、上記と同様の手順で結合定数を求めた。その結果を、表４～７に併記する。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
表４～７から、比較例１のＡＡＬ及び比較例２のＡＯＬでは、フコースα１→６糖鎖（糖鎖Ｎｏ．１５、２０１－２０３、４０１－４１８）とともに、非α１→６である糖脂質系のフコース糖鎖（糖鎖Ｎｏ．７１８、７２２、７２３、７２７、９０９、９１０、９３３）も結合してしまう。また、比較例３のＬＣＡ及び比較例４のＰＳＡでは、フコースα１→６糖鎖を持たない多くの糖鎖（糖鎖Ｎｏ．００３、００５－０１４）も結合してしまう。それに対して、実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬは、フコースα１→６糖鎖を確実に結合し、かつ非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を全く結合していない。しかも、実施例１のＰＴＬの結合定数は、従来のレクチンよりも大きい（結合定数がＫａ＝１．０×１０５Ｍ－１以上）。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖（糖鎖Ｎｏ．４０７－４１３）や四本鎖（糖鎖Ｎｏ．４１８）にも強く結合する。また、シアル酸が付加されていても（糖鎖Ｎｏ．６０１、６０２）、フコースα１→６糖鎖の結合定数が下がっていないことがわかる。　
（６）ＰＴＬ及びＳＲＬを用いた糖タンパク質の検出（ｉ）糖タンパク質の準備　　主な糖鎖構造を下に示す糖タンパク質（１）～（９）、及び糖を有さない（１０）ウシ血清ア
ルブミンを準備した。　
（１）フコースα１→６糖鎖を有するＮ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 を有するチログロブリン（ブタ）。　
（２）フコースα１→６糖鎖を有するＮ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 を有するラクトフェリン（ウシ）。　
（３）フコースα１→６糖鎖を有するＮ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 を有する免疫グロブリンＧ（ヒト）。　
（４）フコースα１→６糖鎖を有さないN型糖鎖を有する糖タンパク質として、下記式：　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 を有するトランスフェリン（ヒト）。　
（５）フコースα１→６糖鎖を有さないＮ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 を有するα１－酸性糖タンパク質（ヒト）。　
（６）高マンノース型糖鎖を有する糖タンパク質として、下記式：　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 を有するインベルターゼ（酵母）。　
（７）フコースを有するＯ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 を有するムチン（ブタ）。　
（８）フコースを有するＯ型糖鎖を持つ糖タンパク質として、下記式：　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 を有するムチン（ウシ）。　
(ii)ウェスタンブロット法による糖タンパク質の検出　　ビオチン標識化した実施例１のＰＴＬ、実施例２のＳＲＬ、比較例１のＡＡＬ、比較例２のＡＯＬ及び比較例３のＬＣＡ、並びに前記糖タンパク質試料を用いて、ウェスタンブロット法による糖タンパク質の検出をおこなった。　
（レクチンのビオチン化）　　レクチンを量り取り、０．１Ｍ　炭酸水素ナトリウム溶液を加え溶解した（濃度；５ｍｇ／ｍｌ）。ビオチン化試薬をジメチルスルホキシドに溶解し、レクチン溶液に加え反応させた。反応物を透析、凍結乾燥し、ビオチン標識化レクチンとした。　
（糖タンパク質のＳＤＳ－ＰＡＧＥとブロッティング）　　上記糖タンパク質試料を１０ｍＭ　リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７　．４、ＰＢＳ）で２ｍｇ／ｍｌに溶解したものをマイクロチューブに１８μｌずつ分注した。ＳＤＳ処理液（Ｓａｍｐｌｅ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（２ＭＥ－）；和光純薬（株）製）６μｌ、及び２－メルカプトエタノール（バイオラッドラボラトリーズ社）１．２５μｌを、各分注液に添加し、５分間煮沸した。これをポリアクリルアミドゲルに泳動し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　ＩＰＶＨ　３０４　Ｆ０　ミリポア社製）に転写した。　
（ビオチン標識化レクチンによる染色）　　上記膜を１％　ＢＳＡを添加した０．８％　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ　７．４、１％　ＢＳＡ　＋　ＴＢＳ）に浸し、室温で１時間振とうした。膜を０．８％　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ　７．４、ＴＢＳ）で３回洗浄後、ビオチン標識化レクチン溶液（２μｇ／ｍｌ）に浸し、室温で１時間振とうした。膜をＴＢＳで３回洗浄後、ＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液１μｇ／ｍｌ（ベクター社製）に浸し、室温で３０分間振とうした。膜をＴＢＳで３回洗浄後、ＰＯＤ　イムノステインセット（和光純薬（株）製）を用いて染色試験を行った。染色試験は、ビオチン標識化レクチンを用いたウェスタンブロット法による糖タンパク質を検出するものである。図１３～１７は、下記の糖タンパク質を、ＰＴＬ（図１３）、ＳＲＬ（図１４）、ＡＡＬ（図１５）、ＡＯＬ（図１６）、又は、ＬＣＡ（図１７）で染色した写真である。　
図１３～１７中、レーン０～６は、以下のとおりである。レーン１：チログロブリン、レーン２：ラクトフェリン、レーン３：免疫イムノグロブリン、レーン４：トランスフェリン、レーン５：α１－酸性糖タンパク質、レーン６：インベルターゼ、レーン０：血清アルブミン（コントロール）　
また、コントロールとして、タンパク質のみを染色するために、ＣＢＢ染色も行なった。その染色写真を図１８に示す。図１８中、レーンＭ、１～６は、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：チログロブリン、レーン２：ラクトフェリン、レーン３：免疫イムノグロブリン、レーン４：トランスフェリン、レーン５：α１－酸性糖タンパク質、レーン６：インベルターゼ、レーン０：血清アルブミン　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 ○・・・検出　　　　×・・・非検出　
表８及び図１３～１８の結果から、比較例３のＬＣＡでは、フコースα１→６糖鎖を有する糖タンパク質とともに、ハイマンノースを有する糖タンパク質（インベルターゼ）も検出してしまう。それに対して実施例１のＰＴＬや実施例２のＳＲＬでは、フコースα１→６糖鎖を有する糖タンパク質のみを検出し、非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を全く検出していないといえる。　
(iii)ＥＬＩＳＡ法による糖タンパク質の検出　　ビオチン標識化した実施例１のＰＴＬ、実施例２のＳＲＬ、比較例１のＡＡＬ、比較例２のＡＯＬ及び比較例３のＬＣＡを用いて、酵素免疫測定法による糖タンパク質の検出評価をおこなった。　
上記糖タンパク質と、コントロールとして糖鎖のないタンパク質であるアルブミンを０．１Ｍ　炭酸緩衝液（ｐＨ　９．５）で１ｍｇ／ｍｌ溶解して、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ　４３９４５４）に添加した後、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳをウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで、３回洗浄後、１％　ＢＳＡ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで適宜希釈したビオチン標識化レクチン溶液を、ウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、１％　ＢＳＡ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を、ウェルに添加して３７℃で３０分間インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｙｓｔｅｍ　（ＫＰＬ社製）を添加し、遮光して室温で１０分間インキュベートした。　
１Ｍ　リン酸で反応を停止し、マイクロプレートリーダー（ＭＰＲ－Ａ４ｉ　東ソー社製）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。この値から反応値（［４５０ｎｍにおける吸光度］－［糖タンパク質をプレートに固相化せず反応させたウェルの値］）を算出した。次いで、各レクチンにおいて、糖タンパク質（チログロブリン）の値を１００％とした各糖タンパク質に対する相互作用強度（相対値）を計算した。算出結果を表９及び図１９～２３に示す。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 ◎・・相対値１２０～８０、○・・相対値８０～５０、△・・相対値５０～１０、×・・相対値１０以下　
表９及び図１９～２３では、比較例１のＡＡＬや比較例２のＡＯＬでは、フコースα１→６糖鎖を有する糖タンパク質とともに、フコースを含むＯ型糖鎖（ムチン）も検出してしまう。それに対して実施例１のＰＴＬや実施例２のＳＲＬでは、フコースα１→６糖鎖を有する糖タンパク質のみを検出し、非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を検出していない。さらに、比較例１～３のレクチンは、ラクトフェリンや免疫グロブリンへの相互作用強度がチログロブリンより劣ってしまうのに対し、実施例１及び２のレクチンでは、ラクトフェリンや免疫グロブリンへの相互作用強度はチログロブリンと同等である。　
(iv)ＥＬＩＳＡ法による腫瘍マーカー糖鎖の検出　　α－フェトプロテイン（以後、ＡＦＰという）は、Ｎ結合型糖鎖を持つ血清に含まれる糖タンパク質であり、健康な成人の血清にほとんど存在しない。一方、良性の肝疾患を持つ患者血清にはαフェトプロテイン－Ｌ１型糖鎖（ＡＦＰ－Ｌ１）が増加し、肝臓ガン患者にはさらにαフェトプロテイン－Ｌ３型糖鎖（ＡＦＰ－Ｌ３）が検出される。従来、その糖鎖の違いがＬＣＡを用いて測定され、測定結果が肝疾患の診断として利用されている。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
ビオチン標識化した実施例１のＰＴＬ、実施例２のＳＲＬ、比較例１のＡＡＬ、比較例２のＡＯＬ及び比較例３のＬＣＡを用いて、酵素免疫測定法によるα－フェトプロテインの結合性評価をおこなった。　
０．１Ｍ　炭酸緩衝液（ｐＨ　９．５）でα－フェトプロテイン（ヒト臍帯血清由来、主にＬ１型糖鎖）、α－フェトプロテイン－Ｌ３（ヒト肝臓ガン細胞の培養上清由来）を０．０１μｇ／ｍｌになるように希釈し、マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ社製）に添加し、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳをウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、１％　ＢＳＡ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで適宜希釈したビオチン標識化レクチン溶液をウェルに添加して３７℃で１時間インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、１％　ＢＳＡ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン溶液を添加して３７℃で３０分間インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回洗浄後、ＴＭＢ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｓｙｓｔｅｍ　（ＫＰＬ社製）を添加し、遮光して室温で１０分間インキュベートした。１Ｍ　リン酸で反応を停止し、マイクロプレートリーダーＭＰＲ－Ａ４ｉ（東ソー社製）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。　
α－フェトプロテイン、α－フェトプロテイン－Ｌ３をレクチンと反応させたプレートの４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、この値から反応値（［４５０ｎｍにおける吸光度］－［糖タンパク質をプレートに固相化せず反応させたウェルの値］）を算出した。次いで、反応値の算出結果を表１０及び図２４～２８に示す。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
表１０から、実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬは、腫瘍マーカーの糖鎖の変化（α－フェトプロテイン－Ｌ１型糖鎖とＬ３型糖鎖）を比較例３のＬＣＡと同等以上に検出できることがわかる。このことから、実施例１のＰＴＬ及び実施例２のＳＲＬを糖鎖に作用させることからなる診断薬又は診断薬キットに利用できる。また、本発明のレクチンの特異性の高さから、フコース１→６糖鎖以外が混在する糖鎖化合物群から目的のフコース１→６糖鎖化合物を他のレクチンよりも正確に検出できる可能性が高い。　
〔実施例３及び４〕（ＮＳＬ及びＬＳＬの製造及び物性測定）（１）ＮＳＬ（実施例３）の製造　　図２９に示す精製工程に従って、クリタケからクリタケレクチン（ＮＳＬ）を単離精製した。　
（抽出）　　クリタケ約４００ｇを凍結乾燥して得られたクリタケ凍結乾燥粉末４０ｇに、０．８ＬのＰＢＳを加え、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目抽出液を得た。この抽出残渣にＰＢＳを０．４Ｌ加え、４℃下で一晩抽出した。遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目抽出液を得た。この抽出残渣にＰＢＳを０．４Ｌ加え、４℃下で一晩抽出した。遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して３回目抽出液を得た。これらの抽出液をあわせてクリタケ抽出液とした。　
（硫酸アンモニウム沈殿）　　上記抽出液１．５Ｌに対して、硫酸アンモニウム濃度が８０％飽和になるように
硫酸アンモニウム約０．８ｋｇを添加して攪拌した。完全に溶解したことを確認した後、７℃下で一晩静置した。この溶液を遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）し、沈殿に純水を少量添加し、懸濁してクリタケ８０％　硫酸アンモニウム沈殿画分を回収した。回収したクリタケ８０％　硫酸アンモニウム沈殿画分を、透析膜（分画６，０００～８，０００）を用いて純水で透析した。　
（疎水クロマトグラフィー）　　上記で得られたクリタケ８０％　硫酸アンモニウム沈殿画分の溶媒を、２Ｍ　硫酸アンモニウム－ＰＢＳに置換した後、２Ｍ　硫酸アンモニウム－ＰＢＳで平衡化したブチル－トヨパール（東ソー社製）に供して、疎水クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、ＰＢＳ溶出画分を合一し、透析及び凍結乾燥を行い、クリタケレクチン粗画分を得た（図３０の←→部）。　
（逆相クロマトグラフィー）　　上記で得られたクリタケレクチン粗画分を、０．０５％　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）－０％　アセトニトリルで平衡化したＣ８カラム（和光純薬（株）製）に供して、逆相クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、０．０５％　ＴＦＡ－４０％　アセトニトリル溶出画分（図３１の←→部）を合一し、常温エバポレートにより溶媒を除去して得られた乾燥粉末を合一して、ＮＳＬを得た。　
電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＧｒａｄｉｅｎｔ１０－１５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液及び分子量マーカーを共に１μｌ使用し、電気泳動を製品プロトコール及び常法に従って行なった。図３２は、ＮＳＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。図中、のレーン１及び２は、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：ＮＳＬ　β－ＭＥ（＋）、レーン２：ＮＳＬ　β－ＭＥ（－）、Ｇｅｌ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ１０－１５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、Ｓａｍｐｌｅ：１μｌ／Ｌａｎｅ、Ｓｔａｉｎ：ｓｉｌｖｅｒ　
上記の１０－１５％　ゲルを用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、主成分がＮＳＬであることを確認した。　
（２）ＬＳＬ（実施例４）の製造　　図３３に示す精製工程に従って、コムラサキシメジからコムラサキシメジレクチン（ＬＳＬ）を単離精製した。　
（抽出）　　コムラサキシメジ約４００ｇを凍結乾燥して得られたコムラサキシメジ凍結乾燥粉末４０ｇに、０．８ＬのＰＢＳを加え、４℃下で２時間抽出した。この液を、遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して１回目抽出液を得た。この抽出残渣にＰＢＳ　０．４Ｌを加え、４℃下で一晩抽出した。遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して２回目抽出液を得た。この抽出残渣にＰＢＳ　０．４Ｌを加え、４℃下で一晩抽出した。遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）後、上清をガーゼろ過して３回目抽出液を得た。これらの抽出液をあわせてコムラサキシメジ抽出液とした。　
（硫酸アンモニウム沈殿）　　上記抽出液１．５Ｌに対して、硫酸アンモニウム濃度が８０％飽和になるように硫酸アンモニウム約０．８ｋｇを添加して攪拌した。完全に溶解したことを確認した後、７℃下で一晩静置した。この溶液を遠心（１０，０００ｒｐｍ、２０ｍｉｎ、４℃）し、沈殿に純水を少量添加し、懸濁してコムラサキシメジ８０％硫酸アンモニウム沈殿画分を回収した。回収したコムラサキシメジ８０％　硫酸アンモニウム沈殿画分を透析膜（分画６，０００～８，０００）を用いて純水で透析した。　
（疎水クロマトグラフィー）　　上記で得られたコムラサキシメジ８０％　硫酸アンモニウム沈殿画分の溶媒を２Ｍ　硫酸アンモニウム－ＰＢＳに置換した後、１Ｍ　硫酸アンモニウム－ＰＢＳで平衡化したブチル－トヨパール（東ソー社製）に供して、疎水クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、ＰＢＳ溶出画分を合一し、透析及び凍結乾燥を行い、コムラサキシメジレクチン粗画分を得た（図３４の←→部）。　
（逆相クロマトグラフィー）　　上記で得られたコムラサキシメジレクチン粗画分を、０．０５％　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）－０％　アセトニトリルで平衡化したＣ８カラム（和光純薬（株）製）に供して、逆相クロマトグラフィー精製を行った。このクロマトグラフィーにおいて、０．０５％　ＴＦＡ－３０％　アセトニトリル溶出画分（図３５の←→部）を合一し、常温エバポレートにより溶媒を除去して得られた乾燥粉末を合一して、ＬＳＬを得た。　
電気泳動装置にはＰｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用し、ゲルにはＧｒａｄｉｅｎｔ　１０－１５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を使用したＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動に供した。試料溶液及び分子量マーカーを共に１μｌ使用し、電気泳動を製品プロトコール及び常法に従って行なった。図３６は、ＬＳＬのＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果である。図中、レーンＭ及びレーン１は、以下のとおりである。レーンＭ：分子量マーカー、レーン１：ＬＳＬ（疎水クロマト、逆相）：β－ＭＥ（＋）、Ｇｅｌ：Ｇｒａｄｉｅｎｔ１０－１５（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）、Ｓａｍｐｌｅ：１μｌ／Ｌａｎｅ、Ｓｔａｉｎ：ｓｉｌｖｅｒ　
上記の１０－１５％　ゲルを用いるＳＤＳ－ＰＡＧＥによって、主成分がＬＳＬであることを確認した。　
（３）ＮＳＬ及びＬＳＬの物性測定（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析）　　実施例３のＮＳＬ及び実施例４のＬＳＬを１０μｇ秤りとり、別々に、実施例１と同様の手順で、ＴＡ（０．１％　ＴＦＡとアセトニトリルの体積比２：１の混合物）に溶解した。ＴＡに溶解した飽和マトリックスとレクチンのＴＡ溶液を体積比４：１で混合したもの１．０μｌをターゲットプレートに滴下してサンプルを調製した。質量分析装置としてブルカーダルトニクス社製Ａｕｔｏｆｌｅｘを用い、ＬＰモードでＮＳＬ及びＬＳＬの分子量を測定した。その結果、分子量は約４，５００であった（図３７及び３８）。　
（アミノ酸配列解析）　　実施例３のＮＳＬのアミノ酸配列を、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ＰＰＳＱ－２１　Ｓｙｓｔｅｍ（（株）島津製作所製）を用いて解析した結果、配列番号５及び６に示すアミノ酸配列の混成体であることがわかった。これらの配列は、いずれも新規であった。　
同様に、実施例４のＬＳＬのアミノ酸配列を、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ　ＰＰＳＱ－２１　Ｓｙｓｔｅｍ（（株）島津製作所製）を用いて解析した結果を、配列番号４に示す。この配列も新規であった。　
（４）ＮＳＬ及びＬＳＬの糖結合特異性の評価　　実施例３のＮＳＬ及び実施例４のＬＳＬのフコースα１→６糖鎖への特異的結合性を、実施例１と同様にして評価した。具体的には、ＮＳＬ及びＬＳＬの結合定数Ｋａを求めた。結果を表１１～１３に示す。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 ＮＴ；ｎｏｔ　ｔｅｓｔｅｄ　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
実施例３のＮＳＬ及び実施例４のＬＳＬは、フコースα１→６糖鎖のみを検出し、非フコースα１→６糖鎖やフコースを持たない糖鎖を全く検出していない。さらに、フコースα１→６糖鎖の三本鎖や四本鎖にも強く結合する。また、シアル酸が付加されていても、フコースα１→６糖鎖に結合定数が下がらない。　
最後に、配列番号２～６に示すタンパク質又はペプチド間の相同性の計算結果を、表１４に示す。この結果から、配列２～６のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも３７％の相同性があれば、フコースα１→６特異的レクチンになり得ることがわかる。　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014

Claims (19)

  1. フコースα１→６特異的レクチンであって、（１）担子菌又は子嚢菌から抽出され、（２）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００～４０，０００であり、及び、（３）フコースα１→６糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ－１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを特徴とする、前記フコースα１→６特異的レクチン。
  2. 前記フコースα１→６糖鎖は、その非還元末端にシアル酸を有するものであることを特徴とする、請求項１に記載の前記フコースα１→６特異的レクチン。
  3. さらに、（４）フコースα１→６糖鎖を含まないハイマンノース糖鎖及び／又は糖脂質に対して実質的に結合しないことを特徴とする、請求項１に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
  4. さらに、（５）フコースα１→６Ｎ結合型の一本、二本、三本及び／又は四本糖鎖に対して結合定数１．０×１０４Ｍ－１以上（２５℃において）で示される親和性を有することを特徴とする、請求項１に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
  5. 前記担子菌が、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科又はタコウキン科に属することを特徴とする、請求項１に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
  6. 前記担子菌が、ツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ又はベニテングタケであることを特徴とする、請求項１に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
  7. さらに、（６）配列番号１に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
  8. （ａ）配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質又はペプチド、若しくは、（ｂ）配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列において、１又は複数のアミノ酸が欠失、挿入又は置換され、かつ、配列番号２～５のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチン。
  9. 配列番号６に示すアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のフコースα１→６特異的レクチン。
  10. 配列番号２～６のいずれかに示すアミノ酸配列と少なくとも３７％以上の相同性を有し、かつ、配列番号２～６のいずれかに示すアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと機能的に同等なタンパク質又はペプチドであるフコースα１→６特異的レクチン。
  11. 担子菌及び／又は子嚢菌の水系媒体抽出物を、（i）疎水クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィー、（ii）アフィニティクロマトグラフィー、又は、（iii）イオン交換クロマトグラフィー及びゲルろ過クロマトグラフィーにかけて、（vi）ＳＤＳ電気泳動法による分子量が４，０００～４０，０００、及び、（v）フコースα１→６糖鎖に対する結合定数が１．０×１０４Ｍ－１以上（２５℃において）で示される親和性を有するレクチンを得ることからなるフコースα１→６特異的レクチンの製造方法。
  12. 前記担子菌が、モエギタケ科、キシメジ科、テングタケ科及びタコウキン科の少なくとも一種から選ばれることを特徴とする、請求項１１に記載
    のフコースα１→６特異的レクチンの製造方法。
  13. 前記担子菌が、ツチスギタケ、スギタケ、ヌメリスギタケモドキ、サケツバタケ、クリタケ、コムラサキシメジ及びベニテングタケから選ばれる少なくとも一種であることを特徴とする、請求項１１に記載のフコースα１→６特異的レクチンの製造方法。
  14. 前記担子菌及び／又は子嚢菌の子実体を使用することを特徴とする、請求項１１に記載のフコースα１→６特異的レクチンの製造方法。
  15. 請求項１に記載のフコースα１→６特異的レクチンに糖鎖を作用させることからなる、フコースα１→６糖鎖の検出方法。
  16. 前記糖鎖が腫瘍マーカーであることを特徴とする、請求項１５に記載のフコースα１→６糖鎖の検出方法。
  17. 請求項１に記載のフコースα１→６特異的レクチンに糖鎖を作用させることからなる、フコースα１→６糖鎖の分別方法。
  18. 前記糖鎖が抗体に結合したものであることを特徴とする、請求項１７に記載のフコースα１→６糖鎖の分別方法。
  19. 請求項１に記載のフコースα１→６特異的レクチンを有効成分とする、フコースα１→６糖鎖を検出するための診断薬又は診断薬キット。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011149826A (ja) * 2010-01-21 2011-08-04 J-Oil Mills Inc 大腸癌の判別方法
JP2011231293A (ja) * 2010-04-30 2011-11-17 Asahi Kasei Corp 糖ペプチド誘導体及びその製造方法
JP2014509850A (ja) * 2011-03-06 2014-04-24 メルク セロノ ソシエテ アノニム 低フコース細胞株およびその使用
US8809496B2 (en) 2009-09-03 2014-08-19 The Noguchi Institute Production method of 11-sugar sialylglycopeptide
JP2015172583A (ja) * 2010-09-17 2015-10-01 国立研究開発法人産業技術総合研究所 肺癌鑑別マーカー
JP2017500058A (ja) * 2013-11-18 2017-01-05 コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジーＫｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ シアル酸結合に特異的なヤマブシタケ由来のレクチン
WO2018174044A1 (ja) * 2017-03-22 2018-09-27 富士フイルム和光純薬株式会社 糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体形成方法

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5531290B2 (ja) * 2010-01-21 2014-06-25 株式会社Ｊ−オイルミルズ 遺伝子
CN103348247B (zh) * 2010-01-21 2015-08-12 J-制油株式会社 胰脏癌的检测方法
JP5480644B2 (ja) * 2010-01-21 2014-04-23 株式会社Ｊ−オイルミルズ ペプチド
WO2015072786A1 (ko) * 2013-11-18 2015-05-21 한국생명공학연구원 헬리시움 에리나슘 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 렉틴
CN104655852B (zh) * 2013-11-21 2017-02-08 苏州中赢医疗科技有限公司 一种系统性红斑狼疮的诊断标志
EP3199950A4 (en) * 2015-02-27 2017-10-25 J-Oil Mills, Inc. Signal enhancer
US20190302028A1 (en) * 2016-01-14 2019-10-03 Diagnos Tear, Ltd. Method for Measuring Tear Constituents in a Tear Sample
US11226334B2 (en) 2016-02-09 2022-01-18 J-Chemical, Inc. Method, biomarker and diagnostic agent for detection of high-risk prostate cancer
CN105785052B (zh) * 2016-05-11 2017-10-10 复旦大学附属中山医院 基于凝集素磁珠的结合珠蛋白异质体诊断肝癌试剂盒
JP7240674B2 (ja) * 2017-09-29 2023-03-16 Ｍｇｃウッドケム株式会社 前立腺癌の検出方法
EP3486326A1 (en) 2017-11-21 2019-05-22 Jennewein Biotechnologie GmbH Method for the purification of n-acetylneuraminic acid from a fermentation broth
JP2021111280A (ja) * 2020-01-15 2021-08-02 キヤノン株式会社 相互認証ペアを形成する方法および認証装置
CN113960232B (zh) * 2021-10-28 2024-02-20 苏州大学 一种基于唾液特异性岩藻糖基化结构糖谱及其检测方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0283337A (ja) 1988-09-18 1990-03-23 Nichirei Corp 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法
JP2002112786A (ja) 2000-10-06 2002-04-16 Gekkeikan Sake Co Ltd フコース特異的レクチン遺伝子
WO2002030954A1 (fr) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de purification d'un anticorps
WO2003084569A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition anticorps

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU1312773A1 (ru) * 1985-03-05 2001-03-20 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН СССР Способ получения l-фукозоспецифичного лектина
JP2007161633A (ja) 2005-12-13 2007-06-28 Gekkeikan Sake Co Ltd α１，６−フコシル化糖特異的レクチン

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0283337A (ja) 1988-09-18 1990-03-23 Nichirei Corp 癌診断薬及びそれを用いた腫瘍マーカーの回収方法
JP2002112786A (ja) 2000-10-06 2002-04-16 Gekkeikan Sake Co Ltd フコース特異的レクチン遺伝子
WO2002030954A1 (fr) 2000-10-06 2002-04-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de purification d'un anticorps
WO2003084569A1 (fr) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Medicament contenant une composition anticorps

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CLYNES RA ET AL.: "Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets", NATURE MED, vol. 6, no. 4, April 2000 (2000-04-01), pages 443 - 446
EPUB, 8 November 2002 (2002-11-08)
KAWAGISHI, H. ET AL.: "A lectin from the mushroom Pholiota aurivella", AGRIC.BIOL.CHEM., vol. 55, no. 10, 1991, pages 2485 - 9, XP008137414 *
MATSUMURA, K. ET AL.: "Carbohydrate binding specificity of a fucose-specific lectin from Aspergillus oryzae: a novel probe for core fucose", J.BIOL.CHEM., vol. 282, no. 21, 2007, pages 15700 - 8, XP008137413 *
NATURE, vol. 227, 1976, pages 680
ODA, Y. ET AL.: "A new fungal lectin recognizing alpha(1-6)-linked fucose in the N-glycan", J.BIOL.CHEM., vol. 278, no. 34, 2003, pages 32439 - 47, XP008137415 *
See also references of EP2305704A4
TOYOHIDE SHINKAWA ET AL.: "The absence of L-fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetyl glucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity", J BIOL CHEM., vol. 278, no. 5, 31 January 2003 (2003-01-31), pages 3466 - 73
WANG, H. ET AL.: "Lectins from mushrooms", MYCOL.RES., vol. 102, no. 8, 1998, pages 897 - 906, XP022451362 *
WIMMEROVA, M. ET AL.: "Crystal structure of fungal lectin", J.BIOL.CHEM., vol. 278, no. 29, 2003, pages 27059 - 67, XP008137663 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8809496B2 (en) 2009-09-03 2014-08-19 The Noguchi Institute Production method of 11-sugar sialylglycopeptide
JP2011149826A (ja) * 2010-01-21 2011-08-04 J-Oil Mills Inc 大腸癌の判別方法
JP2011231293A (ja) * 2010-04-30 2011-11-17 Asahi Kasei Corp 糖ペプチド誘導体及びその製造方法
JP2015172583A (ja) * 2010-09-17 2015-10-01 国立研究開発法人産業技術総合研究所 肺癌鑑別マーカー
JP2014509850A (ja) * 2011-03-06 2014-04-24 メルク セロノ ソシエテ アノニム 低フコース細胞株およびその使用
US9574003B2 (en) 2011-03-06 2017-02-21 Merck Serono S.A. Low fucose cell lines and uses thereof
JP2017500058A (ja) * 2013-11-18 2017-01-05 コリア リサーチ インスティテュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジーＫｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ シアル酸結合に特異的なヤマブシタケ由来のレクチン
US10150799B2 (en) 2013-11-18 2018-12-11 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Sialic acid-specific binding affinity lectin from the mushroom Hericium erinaceum
WO2018174044A1 (ja) * 2017-03-22 2018-09-27 富士フイルム和光純薬株式会社 糖鎖を有する物質とレクチンとの複合体形成方法

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