WO2012117793A1 - 間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材、及びこれを用いた歯組織再生方法 - Google Patents

間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材、及びこれを用いた歯組織再生方法 Download PDF

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WO2012117793A1
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root canal
cells
filling material
stem cells
canal filling
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中島　美砂子
庵原　耕一郎
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独立行政法人 国立長寿医療研究センター
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    • A61L2430/12—Materials or treatment for tissue regeneration for dental implants or prostheses

Definitions

  • the present invention relates to a root canal filling material comprising mesenchymal stem cells and a tooth tissue regeneration method using the same.
  • Non-Patent Document 1 extraction of the pulp after extraction and cutting of the apex or enlargement of the apex by 1.1 mm or more, transplantation again, and filling of the blood clot can regenerate the pulp-like tissue.
  • a root canal filling material having a pulp stem cell-containing cell and an extracellular matrix having the pulp stem cell-attached cell attached to the apical side of the root canal after tooth extraction, pulp extraction A method for regenerating tooth tissue to be injected is also known (Patent Document 1).
  • Dental pulp stem cells are advantageous in that they can be collected from deciduous teeth or wisdom teeth without a heavy burden on the patient. However, it is difficult to collect a sufficient amount of dental pulp stem cells from an elderly patient, and it is considered difficult to put it to practical use in clinical applications. For this reason, in a super-aging society, it is desired to realize the regeneration of dental tissues using a source that is easier to use.
  • the present invention overcomes the disadvantages of the above-described conventional methods, is more easily available, can be clinically applied, and can efficiently promote tooth tissue regeneration and a tooth extraction or non-extraction tooth root canal filling material.
  • An object of the present invention is to provide a used dental tissue regeneration method.
  • the present inventors have extracted or non-extracted roots of mesenchymal stem cells other than dental pulp stem cells, for example, bone marrow stem cells, adipose stem cells, amniotic stem cells or umbilical cord blood cells. It was discovered that the pulp can be regenerated by transplanting it into a tube, and the present invention has been completed.
  • the present invention is a root canal filling material that is inserted into the apical side of a tooth extraction or non-extraction tooth root after extraction of the root or after root canal enlargement cleaning of the infected root canal, It contains mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells and extracellular matrix.
  • the mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells are preferably any one of bone marrow stem cells, adipose stem cells, amniotic stem cells or umbilical cord blood cells.
  • the mesenchymal stem cells excluding the dental pulp stem cells are SP cells, CD31 negative SP cells, CD24 positive cells, CD29 positive cells, CD44 positive cells, CD73 positive cells, CD90 positive cells, CD105 positive cells, CD31 negative cells, CD45 negative cells It is preferable to contain at least one of MHC class II negative cells, CD150 positive cells, CXCR4 positive cells, CD271 positive cells, CD133 positive cells, FLK-1 positive cells, CD166 positive cells, or VEGFR2 positive cells.
  • the root canal filling material further includes a migration factor including at least one of a cell migration factor, a cell growth factor, and a neurotrophic factor.
  • a migration factor including at least one of a cell migration factor, a cell growth factor, and a neurotrophic factor.
  • the mesenchymal stem cells excluding the dental pulp stem cells are transplanted or injected into the apical side of the root canal, and the cell migration factor, cell growth factor, and neurotrophic factor are placed on the crown side of the root canal. It is preferable to attach a migratory factor containing at least one of them.
  • the cell migration factor is at least one of SDF1, VEGF, GCSF, SCF, MMP3, Slit, GM-CSF, and serum.
  • the cell growth factor is at least one of IGF, bFGF, PDGF and serum.
  • the neurotrophic factor is preferably at least one of GDNF, BDNF, NGF, Neuropeptide Y, Neurotrophin 3, and serum.
  • the extracellular matrix is collagen, artificial proteoglycan, gelatin, hydrogel, fibrin, phosphophorin, heparan sulfate, heparin, laminin, fibronectin, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, PLA, PLGA, PEG, PGA, PDLLA, PCL, It is preferably made of a biocompatible material containing at least one of hydroxyapatite, ⁇ -TCP, calcium carbonate, titanium and gold. *
  • the content of mesenchymal stem cells excluding the dental pulp stem cells in the extracellular matrix is preferably 1 ⁇ 10 3 cells / ⁇ l or more and 1 ⁇ 10 6 cells / ⁇ l or less.
  • a method for regenerating tooth tissue by extraction or non-extraction method wherein any one of the above-mentioned is applied to the apical side of the root canal after extraction of the pulp or after root canal enlargement cleaning of the infected root canal.
  • the method further includes a step of enlarging the root canal to make the thickness of the root canal of the apical portion a predetermined size. Is preferred.
  • a method for ectopic regeneration of tooth tissue the step of extracting the tooth of the first individual, and the step of cutting out the root portion of the tooth to a predetermined length.
  • the method further includes the step of reimplanting the root with the regenerated pulp into the alveolar bone.
  • tooth tissue regeneration can be promoted by tooth extraction or non-extraction method.
  • tooth tissue regeneration by a root canal filling material and a tooth tissue regeneration method using the root canal material internal resorption and external absorption are not seen in the regenerated tissue, and odontoblasts are not seen. It is possible to obtain a regenerative tissue that is smoothly arranged.
  • the ectopic regeneration method for tooth tissue according to the present invention is useful in that the tooth tissue can be regenerated in a heterogeneous individual such as a pig having a human gene in consideration of immune rejection (human pig). is there. These are very promising for dental treatment in a super aging society.
  • FIG. 7A shows the results of flow cytometry analysis
  • FIG. 7A (b) shows the separation of additional different fractions from dental pulp tissue using an antibody against CD31
  • FIG. 7A (c) shows phase contrast microscopic images of primary CD31 ⁇ SP cells derived from canine dental pulp tissue on the third day
  • FIG. 7A (d) shows the tenth day. Each experiment was repeated 12 times and a typical experiment was displayed. 2 shows the separation of CD31 ⁇ SP cells from canine bone marrow tissue.
  • FIG. 7B (e) shows the results of flow cytometry analysis
  • FIG. 7B (f) shows the separation of additional different fractions from bone marrow tissue using antibodies against CD31.
  • FIG. 7B (g) shows phase contrast microscopic images of primary CD31 ⁇ SP cells derived from canine bone marrow tissue on day 3, and FIG. The separation of canine adipose tissue-derived CD31 ⁇ SP cells is shown.
  • FIG. 7C (i) is the result of flow cytometry analysis, and FIG. 7C (j) shows the separation of additional different fractions from adipose tissue using antibodies against CD31.
  • FIG. 7C (k) shows phase contrast microscopic images of primary CD31 ⁇ SP cells derived from canine bone marrow tissue on day 3, and FIG.
  • (A), (d), (g) are canine dental pulp tissues, (b), (e), (h) are canine bone marrow tissues, (c), (f), (i) are canine adipose tissue-derived CD31 - a phase contrast microscopic image showing the multilineage differentiation potential of SP cells.
  • (A), (b), (c) are endothelial differentiation potentials using the Matrigel assay, 12 hours after seeding.
  • (D), (e), (f) is neurosphere formation, 14 days after induction of the fourth passage cell population.
  • (G), (h) and (i) are 14 days after the neurosphere is dissociated and the nerve is induced.
  • (J) shows the expression of Neurofilament and neuromodulin mRNA.
  • FIG. 6 shows the migration and proliferation effects of canine pulp, bone marrow and adipose CD31 ⁇ SP stromal cell-derived factor 1.
  • FIG. Data are expressed as mean ⁇ standard deviation and four measurements were taken. The experiment was repeated three times and showed typical experimental results.
  • (A) shows the migration activity using SDF-1 (10 ng / ml) at 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 hours after culture. * P ⁇ 0.001 pulp vs bone marrow, # P ⁇ 0.05 pulp vs fat, ** P ⁇ 0.001 bone marrow vs fat.
  • (B) shows the proliferation activity when SDF-1 (10 ng / ml) was used for 2, 18, 26, and 44 hours after culturing.
  • (Q), (r), (s) are the results of Masson-trichrome staining and show substrate formation.
  • 2 shows the separation of CD31 ⁇ SP cells from porcine dental pulp tissue.
  • A is the result of flow cytometry analysis
  • B shows the separation of antibodies with antibodies against CD31 in further different fractions from dental pulp tissue.
  • C shows phase contrast microscopic images of primary CD31 ⁇ SP cells derived from porcine dental pulp tissue on day 3, and (d) on day 7. Each experiment was repeated 12 times and a typical experiment was displayed.
  • 2 shows the separation of CD31 ⁇ SP cells from porcine bone marrow tissue.
  • E is the result of flow cytometry analysis
  • (f) shows the separation of additional different fractions from bone marrow tissue using antibodies against CD31.
  • (G) shows phase contrast microscopic images of primary CD31 ⁇ SP cells derived from porcine bone marrow tissue on day 3, and (h) on day 7. 2 shows the separation of CD31 ⁇ SP cells from porcine adipose tissue.
  • (I) is the result of flow cytometry analysis and (j) shows the separation of additional different fractions from adipose tissue using antibodies against CD31.
  • (K) shows phase contrast microscopic images of primary CD31 ⁇ SP cells derived from porcine bone marrow tissue on day 3 and (l) on day 7.
  • (A) and (d) are porcine pulp tissues
  • (b) and (e) are porcine bone marrow tissues
  • (c) and (f) are phases indicating the multilineage differentiation potential of porcine adipose tissue-derived CD31 ⁇ SP cells. It is a scanning microscope image.
  • (A), (b), (c) are endothelial differentiation potentials using the Matrigel assay, 12 hours after seeding.
  • (D), (e), (f) are neurospheres 14 days after induction of the fourth passage cell population. The experiment was repeated three times and a typical experiment was displayed. The effect of dental pulp, bone marrow, and fat CD31 ⁇ SP cells on stromal cell-derived factor 1 (SDF1) is shown.
  • (A), (b), (c) shows the case of transplanting porcine pulp CD31 ⁇ SP cells
  • (d) shows the case of transplanting porcine bone marrow CD31 ⁇ SP cells
  • (g ), (H) shows the case of transplanting porcine bone marrow CD31 ⁇ SP cells
  • (i) are optical microscopic images on the 14th day after transplantation when porcine fat CD31 ⁇ SP was transplanted. Examination of immunosuppressive ability of canine dental pulp, bone marrow, and fat culture supernatant using canine self and others PBMC (peripheral blood mononuclear cells). * P ⁇ 0.001 pulp vs bone marrow, # P ⁇ 0.001 pulp vs fat, ⁇ P ⁇ 0.001 bone marrow vs fat.
  • the present invention is a root canal filling material comprising an extracellular matrix and mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram of a root canal filling material 200 according to the present embodiment.
  • the root canal filling material 200 is formed by attaching mesenchymal stem cells 220 excluding dental pulp stem cells to an extracellular matrix 210.
  • “formed to adhere” means that when the extracellular matrix is liquid, fluid, etc., mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells are preferably mixed with the extracellular matrix, preferably uniformly. Means that.
  • the pulp stem cells are preferably uniformly and uniformly on the surface and inside of the structure constituted by the extracellular matrix. It means that mesenchymal stem cells except for are taken up and retained.
  • Mesenchymal stem cells 220 excluding dental pulp stem cells are attached to the apical side of the root canal of the root canal filling material 200.
  • “attached to the apical side of the root canal of the root canal filling material 200” means that the mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells are injected into the apical side of the root canal and transplanted. It means that a tube filler is formed.
  • Mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells may be derived from any tissue other than dental pulp.
  • bone marrow stem cells, adipose stem cells, amniotic stem cells, or umbilical cord blood stem cells can be used.
  • these mesenchymal stem cells may be autologous cells extracted from the tissue of the individual subject to the dental tissue regeneration treatment, or may be extracted from the tissue of an individual other than the subject individual subject to the dental tissue regeneration treatment. Allogeneic cells.
  • the subject undergoing treatment for dental tissue regeneration may be a mammal, particularly a human.
  • Bone marrow stem cells which are examples of mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells, are stem cells derived from bone marrow, and can be extracted and separated from bone marrow tissue by a known method.
  • Adipose stem cells, amniotic stem cells, and umbilical cord blood stem cells are stem cells derived from adipose tissue, amnion tissue, and umbilical cord blood tissue, respectively, and these can also be extracted and separated from each tissue by known methods.
  • Mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells can be used by fractionating cell fractions that express SP cells and / or specific cell markers. Specifically, CD29 positive cells, CD44 positive cells, CD73 positive cells, CD90 positive cells, CD105 positive cells, CXCR4 positive cells, CD31 negative cells, CD45 negative cells, MHC class II negative cells, CD150 positive cells, CXCR4 positive cells , CD271 positive cells, CD133 positive cells, FLK-1 positive cells, CD166 positive cells, or VEGFR2 positive cells. In the present specification, positive may be referred to as “+” and negative as “ ⁇ ”.
  • CD31 negative side population (SP) cells In particular, it is preferable to include CD31 negative side population (SP) cells.
  • CD31-negative side population cells are also referred to as CD31 ⁇ SP cells.
  • CD31 ⁇ SP cells promote blood flow recovery and angiogenesis when transplanted into the ischemic part of the lower limb of mice, and promote differentiation of nerve cells and motor paralysis when transplanted into the ischemic part of rat cerebral infarction.
  • angiogenesis, nerve regeneration, and pulp regeneration are observed in the cavity on the cut surface of the living pulp.
  • CD31 ⁇ SP cells are used as mesenchymal stem cells, it is considered that the pulp regeneration ability is high.
  • SP cells can be separated by a conventional method known to those skilled in the art by a cell sorting method using flow cytometry.
  • a cell fraction expressing a specific cell marker can be obtained by flow cytometry using an antibody or a magnetic bead method.
  • the fraction collected is further cultured, and the mesenchymal stem cells of the third to fifth passages of culture are preferably used for the root trunk filler according to this embodiment.
  • the content of mesenchymal stem cells in the root canal filling material 200 is preferably 1 ⁇ 10 3 cells / ⁇ l or more and 1 ⁇ 10 6 cells / ⁇ l or less. This is because if the content of mesenchymal stem cells is less than 1 ⁇ 10 3 cells / ⁇ l, regeneration of the tooth tissue in the root canal may be insufficient. On the other hand, if the content of mesenchymal stem cells is more than 1 ⁇ 10 6 cells / ⁇ l, an unexpected side effect may occur on the target tooth.
  • Extracellular matrix (Scaffold) 210 is collagen, artificial proteoglycan, gelatin, hydrogel, fibrin, phosphophorin, heparan sulfate, heparin, laminin, fibronectin, alginic acid, hyaluronic acid, chitin, PLA (polylactic acid), PLGA (lactic acid) Glycolic acid copolymer), PEG (polyethylene glycol), PGA (polyglycolic acid), PDLLA (poly-DL-lactic acid), PCL (polycaprolactone), hydroxyapatite, ⁇ -TCP, calcium carbonate, titanium and gold It is preferable that it is comprised from the biocompatible material containing at least any one.
  • Proteoglycan is a type of complex carbohydrate in which a protein and a sugar chain (glycosaminoglycan) are covalently bonded.
  • a sponge-like three-dimensional structure made of nanofibers having a number average diameter of 1 nm to 1000 nm made of a polymer such as a thermoplastic polymer can be used.
  • the porosity of such a three-dimensional structure is preferably 80% to 99.99%.
  • the collagen used as the extracellular matrix is preferably a mixed type I / III collagen, which is a mixture of type I collagen and type III collagen.
  • Type I collagen is basic collagen and is fibrous collagen.
  • Type III collagen forms a thin network-like structure called a reticulated fiber, which is different from collagen fibers, and can form a scaffold such as cells.
  • the proportion of type III collagen is preferably 10% by weight or more and 50% by weight or less. This is because if the proportion of type III collagen exceeds 50% by weight, the mixed collagen may not be solidified. On the other hand, when the proportion of type III collagen is less than 10% by weight, the proportion of type I collagen increases, and angiogenesis as described later may not occur, and dentin may be regenerated. .
  • the root canal filling material 200 is formed by attaching mesenchymal stem cells 220 excluding dental pulp stem cells to the apical side of the extracellular matrix 210.
  • the mesenchymal stem cell 220 is preferably attached to 1/4 to 2/3 of the apical portion of the root canal filling material 200, more preferably 1/3 of the apical portion.
  • the root canal filling material is prepared by preparing a first composition containing the extracellular matrix and mesenchymal stem cells and a second composition containing the extracellular matrix. These can be formed so as to be located at the apex portion and the crown portion, respectively.
  • the total volume is 20 ⁇ l, and 10 ⁇ l to 13 ⁇ l of type I / III mixed collagen is sucked into a pipetteman's chip, and then mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells are collected.
  • 7 ⁇ l to 10 ⁇ l of mixed type I / III mixed collagen for example, collagen XYZ (Nitta Gelatin)
  • sucking into a pipetteman's tip or the like it is preferable to make the suction speed moderate so that bubbles are not generated. This is because if bubbles are generated inside the root canal filling material, the generated bubbles impede cell migration and impair the promotion of tooth tissue regeneration.
  • the pipetman tip preferably has a small inner diameter, for example, a tip having a lower inner diameter of 0.5 to 0.7 mm can be used, for example, H-010-96RS microcapillary chip manufactured by QSP can be used.
  • the shape of the root canal filling material is not particularly limited, and is, for example, a cone, a truncated cone, a cylinder, or the like.
  • the root canal filling material uses a sponge-like three-dimensional structure extracellular matrix
  • the dental pulp stem cells are placed at the apex of the structure containing the extracellular matrix that is formed in a size compatible with the tooth root. Excluding mesenchymal stem cells can be prepared by absorption.
  • the usage volume of the extracellular matrix in the description of the present embodiment is an example, and the filler is not limited to a specific volume, and is appropriately determined according to the volume of the root canal of the tooth that regenerates the pulp. can do.
  • a tooth tissue regeneration method by a non-extraction method using the root canal filling material 200 will be described as an example of a tooth tissue regeneration method.
  • tooth tissue regeneration is performed without tooth extraction on the tooth 100 that is subject to pulpitis.
  • the target tooth is a tooth in which bacterial infection has spread to the crown pulp or the root pulp due to caries, pulpitis or the like.
  • Infected root canal refers to the root canal when bacteria reach the dental pulp and reaches the dentin of the root canal wall, and after cleaning the root canal, removes the bacteria in the infected root canal.
  • Bacteria can be removed, for example, by applying root canal medicine after alternating washing.
  • the root canal filling material 200 is filled into the root canal that has undergone pulpectomy or infection root canal treatment, it is easier to fill the root canal filling material 200 if the root canal is enlarged.
  • blood vessels and nerves are likely to enter from the apical periodontal tissue.
  • the root apex refers to an end portion (tip end portion of the tooth root) coupled to the alveolar bone of the target tooth. Tooth root canal enlargement can be done manually or mechanically with an electric engine reamer file or a rotary engine.
  • the thickness d of the root canal at the apex is preferably 0.6 mm or more and 1.5 mm or less in the diameter of the root canal. This is because when the root canal thickness d is smaller than 0.6 mm, blood vessels and nerves are difficult to enter from the apical periodontal tissue, and the filling of the root canal filling material 200 may be difficult. On the other hand, when the thickness of the root canal is larger than 1.5 mm, it is likely that the target tooth is easily broken due to an unnecessarily heavy load.
  • the root canal filling material 200 is filled into the apical side of the root canal with tweezers or the like. Since the root canal filling material 200 contains a biological material, it may be a biological root canal filling material. It is desirable that the root canal filling material 200 is filled in a portion corresponding to the pulp, where the pulp in the root canal exists. When the extracellular matrix 210 is in a gel form, it cannot be pinched with tweezers or the like, and can be injected by pipetman, injection or the like.
  • gelatin 610 can be injected into the upper part of the root canal filling material 200 and the resin 620 can be capped.
  • Gelatin and resin are not particularly limited, and those usually used in dental treatment can be used.
  • the regenerated tooth tissue is, for example, a pulp intrinsic tissue in the root canal, a blood vessel 400, and a nerve. Further, there is dentin as a tooth tissue regenerated by using a morphogenic factor such as BMPs. Further, when the root canal filling material 200 is filled into the infected root canal, periodontal tissues such as periodontal ligament (periodontal tissue in which teeth are set on the alveolar bone) and cementum are included as regenerated tooth tissues. .
  • the resin 620 is removed once, and as shown in FIG. 3F, a morphogenic factor 630 such as BMPs or a dentinogenic factor is applied to the dental pulp of the crown, and the resin 620 is capped.
  • a morphogenic factor 630 such as BMPs or a dentinogenic factor
  • the dentin 500 can also be regenerated as shown in FIG. 3G.
  • tooth tissue regeneration using the root canal filling material 200 according to the present embodiment internal resorption and external resorption are not seen in the regenerated tissue, and no occlusion cells are seen, and odontoblasts are formed in the dentin wall. Are lined up smoothly.
  • the non-extraction method With the non-extraction method, the occurrence of clots can be kept low and tooth tissue regeneration can be promoted efficiently.
  • root canal can be applied and root canal filling can be waited until bleeding and symptoms disappear after root canal enlargement, which can be brought close to actual clinical treatment.
  • the target tooth 100 may be a tooth in which bacterial infection has spread to the crown pulp or the root pulp due to caries, pulpitis, or the like, but is not limited thereto. That is, the target tooth 100 includes a tooth whose nerve function is reduced and the occlusion is weakened. In such a case, the occlusal sensation can be improved by regenerating the dental pulp by filling the root canal with the root canal filling material 200 after pulp removal.
  • the target tooth 100 is a tooth in which bacterial infection has spread to the apical periodontal tissue (after the bacteria reach the pulp, the dentin and apical periodontium on the root canal wall) Teeth extending to the tissue) are also included. Such teeth are often accompanied by apical periodontitis 110. It is preferable to inject the root canal filling material 200 after the root canal enlargement cleaning of the infected root canal.
  • the root canal filling material according to this embodiment can be used not only for non-extraction but also for extraction.
  • extraction first, an object for which tooth tissue regeneration is desired is extracted. After extraction of the tooth, the root canal of the infected root canal is cleaned, followed by extraction and disinfection. Extraction and disinfection can be performed in the same manner as described above for the non-extraction method.
  • the root apex is cut and opened to transplant the root canal filling material.
  • the cutting point of the root apex is preferably 1 mm to 2 mm from the lower end.
  • the method for cutting the apex can be performed by an ordinary dental method such as an air turbine or an electric engine.
  • the root canal filling material can be injected in the same manner as described in the non-extraction method.
  • FIG. 3I shows that in the form of tooth extraction, after injecting the root canal filling material indicating the filling of the root canal filling material 200 to the apical side of the root canal, gelatin is injected into the upper portion of the root canal filling material, and resin is used. Put the lid on. Thereafter, the extracted tooth can be re-implanted into the extraction cavity.
  • the form of extraction is particularly advantageous in that the affected tooth can be treated with direct vision and there is little damage to the apical periodontal tissue.
  • the root canal filling material according to the second embodiment includes mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells and a migration factor.
  • the migration factor includes at least one of a cell migration factor, a cell growth factor, and a neurotrophic factor.
  • the root canal filling material 200 attaches mesenchymal stem cells 220 excluding dental pulp stem cells to the apical side of the root canal, and at the crown side of the root canal (for example, the upper part of the root canal).
  • a migration factor 230 containing at least one of cell migration factor, cell growth factor and neurotrophic factor is attached to 1/2 to 2/3).
  • the reason why the mesenchymal stem cell 220 is attached to the apical side of the root canal and the migratory factor 230 is attached to the crown side of the root canal is that the mesenchymal stem cell 220 is attached to the crown side of the root canal. This is because there is a possibility of necrosis without supplying nutrients from the tissue, and the mesenchymal stem cell 220 attached to the apical side of the root canal is attached to the crown side of the root canal. This is because tooth tissue regeneration is easily promoted by factors. As shown in FIG. 4B, it is also possible to leave the extracellular matrix 210 on the crown side of the root canal of the root canal filling material 200.
  • the migration factor may include one of a cell migration factor, a cell growth factor, and a neurotrophic factor, or may include two or more in combination.
  • the cell migration factor means a molecule that activates a signal transmission system involved in cell migration by binding to a receptor.
  • the cell growth factor means a molecule that activates a signal transmission system involved in cell growth when it binds to a receptor.
  • the neurotrophic factor means a molecule that activates a signal transmission system related to cell survival by binding to a receptor.
  • MMP3 has high cell migration ability and can be suitably used.
  • IGF insulin growth factor
  • bFGF vascular endothelial growth factor
  • PDGF vascular endothelial growth factor
  • the neurotrophic factor is preferably at least one of GDNF, BDNF, NGF, Neuropeptide Y, Neurotrophin 3 and serum.
  • the serum is preferably autologous serum. Autoserum is the serum of an individual undergoing dental tissue regeneration, and can be obtained by allowing fresh blood to stand for 30 minutes, and then centrifuging and collecting the supernatant.
  • the content of the migration factor in the extracellular matrix to which the migration factor is attached is preferably 0.1 ng / ⁇ l or more and 500 ng / ⁇ l or less. This is because if the migration factor content is less than 0.1 ng / ⁇ l, the degree of migration may be reduced. On the other hand, if the migration factor content is higher than 500 ng / ⁇ l, an unexpected side effect may occur on the target tooth 100.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram for explaining a method of manufacturing the root canal filling material 200 in which the migratory factor 230 is attached to the crown side of the root canal.
  • the root canal filling material 200 includes a first composition containing an extracellular matrix and mesenchymal stem cells excluding dental pulp stem cells, an extracellular matrix,
  • a second composition containing a migration factor can be prepared and injected and transplanted so that they are located at the apex and crown.
  • a total of 20 ⁇ L is prepared, and a mixed type I / III collagen in which a migratory factor is mixed in a pipetman's chip or the like (the mixing ratio of type I collagen and type III collagen is 1: Aspirate 1) 10 ⁇ l to 13 ⁇ l.
  • the pipetman tip preferably has a narrow inner diameter. In this way, the root canal filling material 200 shown in FIG.
  • the use form of the root canal filling material 200 according to the second embodiment is the same as in the first embodiment, the root apex side of the non-extracted root canal after the extraction of the pulp or after the root canal expansion cleaning of the infected root canal, or after the extraction,
  • the apical portion of the open root canal can be filled by cutting the apical portion.
  • the tooth tissue regeneration can be performed more efficiently because it has a migratory factor. Without being seen, the odontoblasts lined up smoothly on the dentin wall.
  • the mesenchymal stem cell 220 excluding dental pulp stem cells is attached to the apical side of the root canal of the root canal filling material 200, and the root canal filling material 200 is configured.
  • the present invention is not limited to such an embodiment, and the mesenchymal stem cells 220 may be uniformly mixed in the entire root canal filling material 200.
  • Such a root canal filling material 200 can also be used in the same manner in both tooth extraction and non-extraction forms, and by using this, internal absorption is not generated in the complete root tooth, and tooth breakage occurs. It is possible to regenerate the tooth tissue in which no cells are seen and odontoblasts are smoothly arranged in the dentin wall.
  • Such a root canal filling material 200 is manufactured by, for example, mixing mesenchymal stem cells 220 and type I / type III mixed collagen, which is an example of an extracellular matrix, uniformly so as not to generate bubbles. .
  • the mesenchymal stem cells 220 excluding dental pulp stem cells are attached to the apical side of the root canal, and the migratory factor 230 is attached to the crown side of the root canal. 200 was configured.
  • the present invention is not limited to such an embodiment, and the mesenchymal stem cell 220 and the migration factor 230 may be mixed uniformly throughout the root canal filling material 200.
  • Such a root canal filling material 200 can also be used in the same manner in both tooth extraction and non-extraction forms, and by using this, internal absorption is not generated in the complete root tooth, and tooth breakage occurs. It is possible to regenerate the tooth tissue in which no cells are seen and odontoblasts are smoothly arranged in the dentin wall.
  • the root canal filling material 200 is manufactured by, for example, uniformly mixing mesenchymal stem cells, migration factors, and type I / type III mixed collagen, which is an example of an extracellular matrix, so as not to generate bubbles.
  • an ectopic regeneration method for tooth tissue using the root canal filling material described in the first to third embodiments includes a step of extracting the tooth of a first individual, a step of cutting a root portion of the tooth into a predetermined length, and injecting the root canal filling material into the root canal And a step of transplanting the root injected with the filler into the second individual.
  • dental pulp stem cells can be used in place of the mesenchymal stem cells constituting the root canal filling material in the first to third embodiments.
  • dental pulp CXCR4 positive cells, SSEA-4 positive cells, FLK-1 positive cells, CD105 positive cells, dental pulp SP cells, CD31 negative and CD146 negative cells, CD24 positive cells, CD150 positive cells, CD73 positive cells and CD271 positive cells preferably include at least one of CD166 positive cells
  • the dental pulp SP cells are CXCR4 positive, SSEA-4 positive, FLK-1 positive, CD31 negative and CD146 negative, CD24 positive, CD105 positive, CD150 positive , CD73-positive, or CD271-positive cell or CD166-positive cell.
  • the first individual is an individual who desires to regenerate teeth and is preferably a mammal, typically a human.
  • the second individual is a mammal other than a human.
  • it may be a mouse or a pig, and an immunodeficient mouse or pig can be used.
  • FIG. 6A shows the tooth 100 of the first individual.
  • the teeth of the first individual used in this embodiment can be obtained by extracting teeth from the first individual.
  • extraction of the pulp is performed in the same manner as described in the first embodiment.
  • FIG.6 (b) is the tooth
  • the root portion of the tooth is cut out according to the size of the tissue to be regenerated.
  • the thickness may be 1 to 30 mm, but is not limited thereto.
  • FIG. 6C schematically shows the root portion 120 to be cut out.
  • one end of the root canal of the cut root portion 120 is sealed using cement or the like.
  • the filler is prepared and injected according to the method described in the first to third embodiments.
  • FIG. 6D shows a state in which the root canal filling material 200 is injected into the root canal of the tooth root portion 120.
  • the root canal filler 200 attaches mesenchymal stem cells 220 to the apical side of the root canal.
  • FIG. 6 (e) shows a root portion 700 into which root canal filling material has been injected.
  • the root portion 700 injected with the root canal filling material 200 is replaced with the second individual, Preferably, it is implanted subcutaneously.
  • the second individual is bred for a predetermined period of time, and the tooth root portion 700 filled with the root canal filling material is taken out, whereby a regenerated tooth tissue can be obtained.
  • the regenerated tooth tissue can be used by being reimplanted into the alveolar bone of the first individual.
  • the method according to the fourth embodiment can be very advantageous in that the dental tissue of one individual can be regenerated by another individual.
  • Canine pulp stem cells were collected from canine pulp tissue extracted from canine upper teeth by the method described in Iohara et al., 2006 (STEM CELLS, Volume 24, Issue 11, pages 2493-2503, November 2006). Primary adipocytes and primary bone marrow cells were isolated from the same dog abdominal subcutaneous fat and rib bone marrow, respectively. These cells were labeled with Hoechst 33342 (Sigma, St. Louis, MO, http://www.sigmaaldrich.com) as described in Iohara et al., 2006.
  • mice BD Fc Block (BD Biosciences, San Jose, CA, http://www.bdbioscience.com) for 30 minutes at 4 ° C. to remove non-specific binding.
  • MCA928 mouse IgG1 negative control
  • MCA928PE mouse IgG1 negative control
  • PE mouse anti-pig CD31
  • LCI-4 mouse anti-pig CD31
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • fetal calf serum Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA. The medium was changed once every 4-5 days. When cells reached 50-60% confluence, they were detached by incubating with 0.02% EDTA at 37 ° C. for 10 minutes, diluted 1: 4 and subcultured.
  • stem cell markers labeled with light cycler Fast Start DNA master SYBR GreenI (Roche Diagnostics, Pleasanton, Calif.) Were used, using canine CXCR4, Sox2, Stat3, BmiOc, T4, Tm, T 10 seconds, 62 ° C. for 15 seconds, 72 ° C. for 8 seconds, using a light cycler (Roche Diagnostics). The primers used are shown below.
  • MMP-3 canine matrix metalloproteinase-3
  • VEGF-A vascular endothelial growth factor
  • GM-CSF granulocyte monocyte colony stimulating factor
  • SDF-1 NGF Real-time RT-PCR propagation of BDNF, Neuropeptide Y, Neurotrophin 3 was also performed (Iohara et al., Submitted). Bone marrow and adipose CD31 ⁇ SP cell expression was normalized to beta actin and then compared to that of dental pulp CD31 ⁇ SP cells.
  • Tetra-color one (registered trademark) (Seikagaku Kogyo, Co., Tokyo, JAPAN) was added to a 96-well plate, and wavelength was measured using a spectrophotometer at 2, 12, 24, and 36 hours after the start of culture. Absorbance at 450 nm was measured to obtain the cell number. Wells without cells were used as negative controls.
  • TAXIScan-FL Effect Cell Institute, Tokyo, JAPAN
  • TAXIScan-FL consists of an etched silicon substrate and a flat glass plate, both of which form two compartments with 6 ⁇ m deep microchannels.
  • Each cell fraction (10 5 cells / ml, 1 ⁇ l) was injected into a single hole bound by a device equipped with a stainless steel holder. 10 ng / ⁇ l SDF-1, 1 ⁇ l was injected into the opposite hole. Video images of cell migration were taken over 6 hours.
  • First composition of 5 ⁇ 10 5 cells of Canine pulp, bone marrow and adipose CD31 ⁇ SP cells in passage 3 to passage 4 labeled with 10 ⁇ l of collagen TE (Nitta gelatin), and 10 ⁇ l of collagen TE and the final A root canal filler was prepared consisting of a second composition containing SDF-1 at a concentration of 15 ng / ⁇ l. This filler was filled into the root canal so that the first composition was autografted into the lower root canal and the second composition was in the upper root canal.
  • the 5 ⁇ m thick paraffin section was deparaffinized and incubated with 0.3% Triton X-100 (Sigma Chemical; St Louis, MO) for 15 minutes. After incubation with 2.0% normal goat serum to block non-specific binding, it was incubated overnight at 4 ° C. with goat anti-human PGP 9.5 (Ultra Clone Ltd.) (1: 10000). After washing 3 times with PBS, the bound antibody was reacted with a biotinylated goat anti-rabbit IgG secondary antibody (Vector) (1: 200) for 1 hour at room temperature. This section was also deployed for 10 minutes with ABC reagent (Vector Laboratories, Burlingame, CA) using DAB chromogen.
  • Triton X-100 Sigma Chemical; St Louis, MO
  • the relative amount of regenerated pulp in each sample 14 days after transplantation was measured by obtaining an entire image of the tooth with a stereomicroscope (Leica, M205FA). Three sections spaced by 150 ⁇ m were examined for each of 5 teeth each transplanted with canine pulp, bone marrow and adipose CD31 ⁇ SP cells and SDF-1. The contour of the screen image of the newly regenerated pulp tissue and dentin was tracked, and the surface area of this contour in the root canal was determined using Leica Application Suite software. The ratio of regeneration area to root canal area was calculated in three sections of each tooth to determine an average value. Statistical analysis was performed using unpaired Student's t-test. Data were expressed as the mean ⁇ standard deviation of 5 measurements.
  • CD31 ⁇ SP cell populations contained similar cell phenotypes, ie, astrocytes and spindle cells with multiple long processes.
  • Astrocytes contained large nuclei surrounded by granules.
  • Spindle cells were neuron-like cells with elongated processes and slight cytoplasm. 7 (c), (d), (g), (h), (k), and (l).
  • Single canine dental pulp and adipose CD31 ⁇ SP cells seeded in 35 mm dishes formed colonies in 10 days, and single canine bone marrow CD31 ⁇ SP cells formed colonies in 14 days. This result indicates that these cells have colony forming activity.
  • the efficiency of attachment and proliferation of canine pulp, bone marrow and adipose CD31 ⁇ SP cells was estimated to be 8%, 6% and 7%, respectively.
  • the frequency of dental pulp CFU was estimated to be 80% in canine dental pulp CD31 ⁇ SP cells, 75% in canine bone marrow CD31 ⁇ SP cells, and canine fat CD31 ⁇ . It was estimated at 80% in SP cells.
  • CD31 ⁇ SP cell “traits as stem cells” with canine bone marrow and adipose CD31 ⁇ SP cells. These three CD31 ⁇ SP cell populations were positive for CD29, CD44, and CD90.
  • the proportion of CD34 + cells is 4.4% for canine dental pulp CD31 ⁇ SP cells, compared to 9.8% for canine bone marrow CD31 ⁇ SP cells and 7.1% for canine fat CD31 ⁇ SP cells. It was low.
  • CD105 + cells The proportion of CD105 + cells is 60.2% for canine dental pulp CD31 ⁇ SP cells, 64.9% for canine bone marrow CD31 ⁇ SP cells, compared to 85.5% for canine adipose CD31 ⁇ SP cells. It was low. These were generally negative for CD146 at the fourth passage. CXCR4 was expressed more in canine dental pulp and adipose CD31 ⁇ SP cells than in canine bone marrow CD31 ⁇ SP cells. The results are shown in Table 3.
  • a stem cell marker Stat3, Bmil, Sox2, Tert, CXCR4 are dogs pulp CD31 - in SP cells, canine bone marrow and fat CD31 - was expressed in SP cells comparable. This result suggests that these three cell populations have the same level of stem cell properties.
  • BDNF was expressed more in canine bone marrow CD31 ⁇ SP cells than in canine dental pulp and adipose CD31 ⁇ SP cells.
  • GDNF was similarly expressed in all three cell populations. The results are shown in Table 4.
  • CD31 ⁇ SP cells can differentiate into vascular endothelial cells (FIGS. 8 (a), (b), (c)), neurosphere differentiation ability (FIGS. 8 (d), (e), (f)), The ability to differentiate into neurons (FIGS. 8 (g), (h), (i)) was compared in three cell populations : canine dental pulp, bone marrow, and adipose CD31 ⁇ SP cells. An extensive network of cords and tubes was observed on matrigel by 12 hours of culture in all cell populations (FIGS. 8 (a), (b), (c)). Clusters and proliferating neurospheres were detected 14 days after the start of culture. There was no significant difference in the frequency and quantity of neurospheres among the three cell populations.
  • the cells in the regenerated tissue were star-shaped or spindle-shaped (FIGS. 10 (d), (e), and (f)).
  • fibrous matrix formation was seen in bone marrow and a portion of adipose CD31 ⁇ SP cell transplantation (FIGS. 10 (e), (f)).
  • strong calcification was observed in the dental pulp (FIG. 10 (i)), but most of the dental pulp CD31 ⁇ SP cells and SDF-1 transplantation. There was no calcification, and a slight calcification was observed in bone marrow CD31 ⁇ SP cells and SDF-1 transplantation.
  • Periostin mRNA expression was much less in canine dental pulp, bone marrow, and regenerated tissue from adipose CD31 ⁇ SP cell transplantation than in normal periodontal tissue.
  • Syndecan 3, tenascin C, and vimentin, which are known to be highly expressed in the dental pulp, were also expressed in all regenerated tissues in the same manner as compared with normal dental pulp tissues.
  • the differentiation markers for fat, bone, dentin, aP2, Osterix, and Dspp were not expressed in any regenerated tissue. The results are shown in Table 5.
  • mice IgG1 negative control (MCA928) (AbD Serotec Ltd, Oxford, UK, http://www.serotec.com)
  • mouse IgG1 negative control Physicalerythrin, PE
  • MCA928PE mouse anti-pig CD31
  • PE mouse anti-pig CD31
  • LCI-4 AbD Serotec
  • Mouse IgG1 negative control (AbD Serotec Ltd.), mouse IgG1 negative control (fluorescein isothiocyanate, FITC) (MCA928F) (AbD Serotec), mouse IgG1 negative control (Phycoerythrin-Cy5, PE-CyC) (MCA28C Mouse IgG1 negative control (Alexa 647) (MRC OX-34) (AbD Serotec) and CD14 (Alexa Floor 647) (TuK4) (AbD Serotec), CD29 (PE-Cy5) (MEM-101A) (eBioscience), CD31 (PE) (LCI-4) (AbD Serotec), D34 (PE) (581) (Beckman Coulter), CD44 (PE-Cy5) (IM7) (eBioscience), CD73 (Alexa Floor 647) (AD2) (eBioscience), CD90 (Alexa Floor 647) (F15-42-1) ) (AbD Serotec), CD105 (FITC) (MEM-229) (abcam), CD117
  • CD133 Alexa Floor 647) (293C3) (Miltenyi Biotec), CD146 (FITC) (OJ79c) (AbD Se) rotec), CD150 (FITC) (A12) (AbD Serotec), CD271 (APC) (ME20.4-1H4) (Miltenyi Biotec.), CXCR4 (FITC) (12G5) (R & D).
  • Real-time RT-PCR proliferation consists of stem cell markers labeled with light cycler Fast Start DNA master SYBR Green I (Roche Diagnostics, Pleasanton, Calif.), Porcine C Sox2, Tert, Bmi1, CXCR4, vascularization factor Granulocyte monocyte colony stimulating factor (GM-CSF), matrix metalloproteinase-3 (MMP-3), vascular endothelial growth factor A (VEGF-A), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), glial cell-derived nerve Nutritional factor (GDNF), nerve growth factor (NGF), neuropeptide Y (Iohara et al., 2008 (STEM CELLS, Volume 26, Issue 9, pages 2408-2418, September 2008); Sugiyama et al., 2011 (Tissue Engineering Part A.
  • This tooth root was transplanted subcutaneously into a 5-week-old SCID mouse (CB17, CLEA, Tokyo, JAPAN, http://www.clea-japan.com). Dental pulp, bone marrow and adipose CD31 ⁇ SP cells from four different pigs were implanted into each of the two roots. After 14 days, a total of 24 roots were collected for histological studies.
  • CD31 ⁇ SP cell populations contained similar cell phenotypes, ie, astrocytes and spindle cells with multiple long processes.
  • Astrocytes contained large nuclei surrounded by granules.
  • Spindle cells were neuron-like cells with elongated processes and slight cytoplasm.
  • a stem cell marker Sox2, Tert, Bmi1, CXCR4, Stat3 mRNA is dental pulp CD31 - in SP cells, bone marrow and fat CD31 - was expressed in SP cells comparable. This result suggests that these three cell populations have stem cell properties to the same extent.
  • Angiogenic factors and / or neurotrophic factors, GM-CSF, MMP-3, VEGF-A, BDNF, GDNF, NGF, and neuropeptide Y were similarly expressed in all three cell populations. The results are shown in Table 8.
  • Proliferative activity when SDF-1 was added was similar in porcine dental pulp CD31 ⁇ SP cells, porcine bone marrow and adipose CD31 ⁇ SP cells (FIG. 13 (a)).
  • the migration activity when SDF-1 shown by TAXIScan-FL was added was also the same in dental pulp CD31 ⁇ SP cells and bone marrow and adipose CD31 ⁇ SP cells (FIG. 13 (b)).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • each cell was cultured in DMEM supplemented with 10% FBS for 3 days, and each culture supernatant was collected, and the Centrifugal Filter Units (MILLI) PORE) was used 10 times concentrated.
  • MILLI Centrifugal Filter Units
  • the culture supernatant of dental pulp, bone marrow, and adipose CD31 ⁇ SP cells was added to each, and the proliferation activity was measured over time using TetraColorONE (SEIKAKU BIOBUSINESS CORPRATION) (MTT method). The effect was compared.
  • Pig pulp, bone marrow, fat CD31 - SP cells result of examining the mRNA involved in immunogenic in Real-time RT-PCR of, MHC expression (major histocompapitibility complex) class IIDRB, CD80, CD40 are three in all I could't see it.
  • MHC class IA expression was very low in pulp 0.07, bone marrow 0.25, and fat 0.08, compared with porcine unsorted total pulp cells.
  • CD40, CD80, CD86 and MHC class II were all negative, and MHC class I was 36.0% of dental pulp and 73.8% of bone marrow. The fat was 80.0%. Therefore, it was suggested that all three species have low immunogenicity.
  • MLR mixed lymphocyte reactions
  • Root canal filling material 210 Extracellular matrix 220 Mesenchymal stem cell 230 Migration factor 400 Blood vessel 500 Dentin 610 Gelatin 620 Resin 630 Morphogenetic factor 640 Cement 700 Root canal Root part filled with filler

Abstract

　入手しやすく臨床的応用が可能であり、かつ効率的に歯組織再生を促進することができる、抜歯もしくは非抜歯法の根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法を提供することを目的とする。抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に挿入される、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０と、細胞外基質２１０とを含んでなる根管充填材２００、および抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側に、根管充填材を注入する工程を含む、抜歯もしくは非抜歯法による歯組織再生方法を提供する。

Description

間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材、及びこれを用いた歯組織再生方法
　本発明は、間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法に関する。
　現在、歯を失う原因は、破折を含めると約半分がう蝕によるもので、歯髄を抜くと歯を失う可能性が激増することが知られている。歯の平均寿命は現在５７歳といわれ、一生自分の歯で咬むことを考えると、歯の寿命は２０年以上高める必要がある。８０２０運動（８０歳になっても自分の歯を２０本以上残す運動）にもかかわらず、現在８０歳の人の歯の達成率は２１％で、日本歯科医師会の打ち立てた５０％の目標達成にはう蝕治療の抜本的改革が必要である。
　歯髄を除去、すなわち抜髄すると、修復象牙質形成能及び感染防御機構が喪失し、痛みという警告信号の喪失により、う蝕拡大の危険性が増加する。また、抜髄治療に完璧な方法はなく、抜髄・根管充填後、歯冠側からの漏えいにより根尖病巣が生じたり、垂直性破折や審美性の消失、術後疼痛が生じたりする可能性もある。
　従って、超高齢社会では、安易に抜髄を行うことを避け、歯の延命化をめざして、歯再生医療技術を組み入れた象牙質・歯髄再生による新しいう蝕・歯髄炎治療法を開発することは非常に重要である。
　一方、歯髄再生に関しては、これまで、歯根未完成歯において、抜歯して抜髄・根管治療をした後に再度移植すると歯髄が再生されるといわれている。根尖部に病変を伴う歯根未完成歯でも、抜歯して徹底的な根管拡大・清掃を行い、セメント・象牙境まで血餅を満たし、Mineral trioxide aggregate（ＭＴＡ）で窩洞を完全封鎖することにより、歯髄様組織が再生されるとの報告がある。
　また、イヌの健全歯根完成歯においては、抜歯後抜髄し、根尖部を切断するあるいは根尖部を１．１ｍｍ以上拡大し再び移植し、血餅を充填すると歯髄様組織の再生がみられるといわれている（非特許文献１）。
　上述の根管内歯髄再生は、歯根未完成歯についての報告が大半であり、根管内に再生された組織が血管や神経を伴う歯髄固有の組織であることの証明もなされていない。また、すべて、一旦抜歯して生体外で根管拡大・清掃を行い、再移植して血餅を充填している。
　治療対象となる歯に対して、抜歯、抜髄後、根管の根尖側に、歯髄幹細胞を含む細胞と、前記歯髄幹細胞を含む細胞を付着させた細胞外基質とを有する根管充填材を注入する歯組織再生方法も知られている（特許文献１）。
　歯髄幹細胞は、患者の大きな負担なく、乳歯あるいは智歯から採取することができる点で有利である。しかし、高齢の患者から十分な量の歯髄幹細胞を採取することは難しく、臨床的応用においては実用化が難しいと考えられる。このため、超高齢化社会において、より利用しやすい供給源を用いて、歯組織の再生を実現することが望まれる。
国際公開第２００９／１１３７３３号
Laureys et al., Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2001 Apr;119(4):335.
　本発明は、上記従来方法の欠点を克服し、より入手しやすく臨床的応用が可能であり、かつ効率的に歯組織再生を促進することができる、抜歯もしくは非抜歯根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を達成するため鋭意検討を行った結果、歯髄幹細胞以外の間葉系幹細胞、例えば、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞のいずれかを抜歯もしくは非抜歯根管に移植することによっても、歯髄の再生が可能であることを発見し、本発明を完成するに至った。
　従って、本発明は、一実施の形態によれば、抜髄後もしくは感染根管の根管拡大清掃後、抜歯もしくは非抜歯の根管の根尖側に挿入される根管充填材であって、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞と、細胞外基質とを含んでいる。歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞のいずれか一つであることが好ましい。
　前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が、ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ３１陰性細胞、ＣＤ４５陰性細胞、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ陰性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＦＬＫ－１陽性細胞，ＣＤ１６６陽性細胞、もしくはＶＥＧＦＲ２陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことが好ましい。
　前記根管充填材が、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子をさらに含むことが好ましい。特には、根管充填材において、前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞を根管の根尖側に移植あるいは注入するとともに、根管の歯冠側に細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子を付着させていることが好ましい。
　前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ、ＧＭ－ＣＳＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つであることが好ましい。
　前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つであることが好ましい。
　前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３及び血清のうち少なくともいずれか一つであることが好ましい。
　前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β－ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくともいずれか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。　
　前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下であることが好ましい。
　本発明は、また別の局面によれば、抜歯もしくは非抜歯法による歯組織再生方法であって、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の根管の根尖側に、前述のいずれかに記載の根管充填材を注入する工程を含む。
　前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する工程の前に、前記根管を拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにする工程をさらに含むことが好ましい。
　本発明は、また別の局面によれば、歯組織の異所再生方法であって、第１の個体の歯の抜髄を行う工程と、前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程と、抜髄後の根管の一端を封鎖する工程と、前記根管に、間葉系幹細胞と細胞外基質とを含む根管充填材を注入する工程と、充填材を注入した歯根を第２の個体に移植する工程とを含み、さらに好ましくは、歯髄が再生された歯根を歯槽骨内に再植する工程を含む。
　本発明に係る根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法によれば、抜歯もしくは非抜歯法で歯組織再生を促進させることができる。根管充填材及びこれを用いた歯組織再生方法による歯組織再生では、再生組織に内部吸収及び外部吸収が見られず、且つ、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んだ再生組織を得ることができる。また、本発明に係る歯組織の異所再生方法によれば、例えば免疫拒絶を考慮したヒトの遺伝子をもつブタ（ヒトブタ）などの異種個体において、歯組織を再生することができる点で有用である。これらは、超高齢化社会における歯科治療において非常に有望である。
第１実施形態に係る根管充填材の説明図である。 第１実施形態に係る根管充填材の製造工程を説明する説明図である。 歯髄炎に罹患している歯の説明図である。 抜髄後の根管拡大処置を行ったところを説明する模式図である。 根管充填材を充填するところを説明する模式図である。 スポンゼル（ゼラチン）及びレジンを注入したところを説明する模式図である。 歯髄再生及び血管再生を示す模式図である。 形態形成因子及びレジンを注入したところを説明する模式図である。 象牙質再生を示す模式図である。 細菌が根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる根尖性歯周炎の模式図である。 抜歯後に抜髄及び消毒し、根尖部を切断して開口し、根管に、根管充填材を充填するところを説明する模式図である。 第２実施形態に係る根管充填材の説明図であり、そのうち（ａ）は根管の歯冠側に遊走因子を付着させている構成であり、（ｂ）は歯冠部側に細胞外基質を残す構成である。 第２実施形態に係る根管充填材の製造工程を説明する説明図である。 充填材を注入した歯根を免疫不全マウスへ移植する、歯組織の異所再生方法を示す概念図である。 イヌ歯髄組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の分離を示す。図７Ａ（ａ）はフローサイトメトリー分析結果であり、図７Ａ（ｂ）は、歯髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。図７Ａ（ｃ）は、イヌ歯髄組織由来の初代ＣＤ３１－ＳＰ細胞の３日目、図７Ａ（ｄ）は１０日目の位相差顕微鏡画像を示す。実験はそれぞれ１２回繰り返し、典型的な実験を表示した。 イヌ骨髄組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の分離を示す。図７Ｂ（ｅ）はフローサイトメトリー分析結果であり、図７Ｂ（ｆ）は、骨髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。図７Ｂ（ｇ）は、イヌ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１－ＳＰ細胞の３日目、図７（ｈ）は１０日目の位相差顕微鏡画像を示す。 イヌ脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の分離を示す。図７Ｃ（ｉ）はフローサイトメトリー分析結果であり、図７Ｃ（ｊ）は、脂肪組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。図７Ｃ（ｋ）は、イヌ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１－ＳＰ細胞の３日目、図７Ｃ（ｌ）は１０日目の位相差顕微鏡画像を示す。 （ａ）、（ｄ）、（ｇ）はイヌ歯髄組織、（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）はイヌ骨髄組織、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）はイヌ脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の多系列分化能を示す位相差顕微鏡画像である。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、マトリゲルアッセイを用いた内皮分化能であり、播種１２時間後である。（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、ニューロスフェア形成であり、第４継代の細胞集団を誘導後１４日である。（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）は、ニューロスフェアを解離させて神経誘導した後１４日である。（ｊ）は、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ、及びｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎのｍＲＮＡの発現を示す。実験は三度繰り返し、典型的な実験を表示した。 イヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰの間質細胞由来因子１の遊走及び増殖効果を示す。データは、平均値±標準偏差で表し、４回の測定を行った。実験は３回繰り返し、典型的な実験結果を示した。（ａ）は、培養後０、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４時間の、ＳＤＦ－１（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いた場合の遊走活性を示す。＊Ｐ＜０．００１　歯髄ｖｓ骨髄，＃Ｐ＜０．０５　歯髄ｖｓ脂肪，＊＊Ｐ＜０．００１　骨髄ｖｓ脂肪。（ｂ）は、培養後２、１８、２６、４４時間の、ＳＤＦ－１（１０ｎｇ／ｍｌを用いた場合の増殖活性を示す。 本願発明に係る充填材を抜髄後のイヌ根管に自家移植した際の歯髄組織の完全な再生を示す。（ａ）、（ｄ）、（ｇ）は、イヌ歯髄ＣＤ３１－ＳＰを移植した場合であり、（ｂ）、（ｅ）、（ｈ）は、イヌ骨髄ＣＤ３１－ＳＰを移植した場合であり、（ｃ）、（ｆ）、（ｉ）、は、イヌ脂肪ＣＤ３１－ＳＰを移植した場合の顕微鏡画像である。（ａ）～（ｆ）は移植後１４日であり、（ｇ）～（ｉ）は移植後２８日である。図中、矢印はマトリックスの形成を、ｍは石灰化した組織を示す。（ｊ）は、１４日における、新たに再生された組織の面積の、根管の面積に対する比率を示す。データは、平均値±標準偏差であらわした。 本願発明に係る充填材を抜髄後のイヌ根管に自家移植した際の歯髄組織の完全な再生を示す。（ｋ）、（ｎ）、（ｑ）は、イヌ歯髄ＣＤ３１－ＳＰを移植した場合であり、（ｌ）、（ｏ）、（ｒ）は、イヌ骨髄ＣＤ３１－ＳＰを移植した場合であり、（ｍ）、（ｐ）、（ｓ）は、イヌ脂肪ＣＤ３１－ＳＰを移植した場合の顕微鏡画像である。（ｋ）、（ｌ）、（ｍ）はＢＳ－１レクチンで免疫染色した結果を示す共焦点顕微鏡像であり、新たに形成された毛細血管を示す。（ｎ）、（ｏ）、（ｐ）は、ＰＧＰ９．５で免疫染色した結果である。（ｑ）、（ｒ）、（ｓ）は、マッソン・トリクロム染色した結果であり、基質形成を示す。 ブタ歯髄組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の分離を示す。（ａ）はフローサイトメトリー分析結果であり、（ｂ）は、歯髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。（ｃ）は、ブタ歯髄組織由来の初代ＣＤ３１－ＳＰ細胞の３日目、（ｄ）は７日目の位相差顕微鏡画像を示す。実験はそれぞれ１２回繰り返し、典型的な実験を表示した。 ブタ骨髄組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の分離を示す。（ｅ）はフローサイトメトリー分析結果であり、（ｆ）は、骨髄組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。（ｇ）は、ブタ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１－ＳＰ細胞の３日目、（ｈ）は７日目の位相差顕微鏡画像を示す。 ブタ脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の分離を示す。（ｉ）はフローサイトメトリー分析結果であり、（ｊ）は、脂肪組織からのさらなる異なる画分の、ＣＤ３１に対する抗体を用いた分離を示す。（ｋ）は、ブタ骨髄組織由来の初代ＣＤ３１－ＳＰ細胞の３日目、（ｌ）は７日目の位相差顕微鏡画像を示す。 （ａ）、（ｄ）はブタ歯髄組織、（ｂ）、（ｅ）はブタ骨髄組織、（ｃ）、（ｆ）、はブタ脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の多系列分化能を示す位相査顕微鏡画像である。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、マトリゲルアッセイを用いた内皮分化能であり、播種１２時間後である。（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、第４継代の細胞集団を誘導後１４日のニューロスフェアである。実験は三度繰り返し、典型的な実験を表示した。 間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）に対する歯髄、骨髄、脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の効果を示す。データはサンプル数４の平均値±標準偏差で表す。実験は三度繰り返し、典型的な実験を表示した。non-paired Student’s t test にて統計解析した。（ａ）０、３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４時間後の遊走能。ＳＤＦ－１（１０ｎｇ／ｍｌ）投与。＊Ｐ＜０．００１　歯髄ｖｓ骨髄、＃Ｐ＜０．０５　歯髄ｖｓ脂肪、＊＊Ｐ＜０．００１骨髄ｖｓ脂肪。（ｂ）２、１８、２６、４４時間後の増殖能　ＳＤＦ－１（１０ｎｇ／ｍｌ）投与。 免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）へのｉｎ　ｖｉｖｏ皮下移植後の歯髄再生を示す。（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、ブタ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞を移植した場合、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）は、ブタ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞を移植した場合、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）は、ブタ脂肪ＣＤ３１－ＳＰを移植した場合の、いずれも、移植後１４日目の光学顕微鏡画像である。 イヌ自己および他者ＰＢＭＣ（末梢血単核球）を用いたイヌ歯髄、骨髄、脂肪培養上清の免疫抑制能の検討。＊Ｐ＜０．００１　歯髄ｖｓ骨髄、＃Ｐ＜０．００１　歯髄ｖｓ脂肪、†Ｐ＜０．００１　骨髄ｖｓ脂肪。
　以下に、本発明を図面を参照して詳細に説明する。以下の説明は、本発明を限定するものではない。
（第１実施形態）
　本発明は、第１実施形態によれば、細胞外基質と、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞とを含んでなる根管充填材である。図１は、本実施形態に係る根管充填材２００の説明図である。根管充填材２００は、細胞外基質２１０に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を付着させて形成される。ここで、「付着させて形成される」とは、細胞外基質が液体、流体等の場合には、細胞外基質に、好ましくは均一に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が混合されていることを意味する。いっぽう、細胞外基質が、後述するスポンジ状の三次元構造体等、一定の形状を有する形態の場合には、細胞外基質が構成する構造体の表面及び内部に、好ましくは均一に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が取り込まれ、保持されていることをいう。歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０は、根管充填材２００の根管の根尖側に付着される。ここで、「根管充填材２００の根管の根尖側に付着される」とは、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が、根管の根尖側に注入され、移植されるように根管充填材が形成されることをいう。
　歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞は、歯髄以外の任意の組織由来のものであってよい。例えば、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞、もしくは臍帯血幹細胞を用いることができる。また、これらの間葉系幹細胞は、歯組織再生の処置を受ける対象の個体自身の組織から抽出した自家細胞でもよいし、また、歯組織再生の処置を受ける対象個体以外の個体の組織から抽出した同種細胞でもよい。歯組織再生の処置を受ける対象は、哺乳動物であってよく、特にはヒトである。
　歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞の一例である骨髄幹細胞は、骨髄由来の幹細胞であって、既知の方法により骨髄組織から抽出、分離することが出来る。また、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞もそれぞれ、脂肪組織、羊膜組織、臍帯血組織由来の幹細胞であって、これらも既知の方法により、各組織から抽出、分離することが出来る。
　歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞は、ＳＰ細胞、及び／または、特定の細胞マーカーを発現する細胞画分を分取して用いることができる。具体的には、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ３１陰性細胞、ＣＤ４５陰性細胞、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ陰性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＦＬＫ－１陽性細胞，ＣＤ１６６陽性細胞、またはＶＥＧＦＲ２陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことができる。なお、本明細書において、陽性を「＋」、陰性を「－」と指称することもある。
　特には、ＣＤ３１陰性ｓｉｄｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ（ＳＰ）細胞を含むことが好ましい。なお、本明細書において、ＣＤ３１陰性ｓｉｄｅ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ細胞は、ＣＤ３１－ＳＰ細胞とも指称する。ＣＤ３１－ＳＰ細胞は、マウス下肢虚血部に移植すると血流回復・血管新生が促進され、ラット脳梗塞虚血部に移植すると神経細胞の分化促進、運動麻痺が回復する。また、イヌの生活歯髄切断面上に移植すると生活歯髄切断面上の窩洞内に血管新生・神経再生・歯髄再生が見られる。間葉系幹細胞としてＣＤ３１－ＳＰ細胞を用いる場合、歯髄再生能力は高いと考えられる。
　ＳＰ細胞は、フローサイトメトリーを利用したセルソーティング法による、当業者には既知の通常の方法を用いて分離することができる。特定の細胞マーカーを発現する細胞画分は、抗体を用いたフローサイトメトリーや磁気ビーズ方法によって得ることが出来る。分取した画分をさらに培養し、培養の第３～第５継代の間葉系幹細胞を、本実施形態にかかる根幹充填材に用いることが好ましい。
　根管充填材２００における間葉系幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下とすることが好ましい。間葉系幹細胞の含有率が、１×１０３セル／μｌよりも少ないと、根管内の歯組織の再生が不十分なものとなる可能性があるからである。一方、間葉系幹細胞の含有率が、１×１０６セル／μｌよりも多いと、対象の歯に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があるからである。
　細胞外基質（Ｓｃａｆｆｏｌｄ）２１０は、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ（ポリ乳酸）、ＰＬＧＡ（乳酸グリコール酸共重合体）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＧＡ（ポリグリコール酸）、ＰＤＬＬＡ（ポリ－ＤＬ－乳酸）、ＰＣＬ（ポリカプロラクトン）、ハイドロキシアパタイト、β－ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくともいずれか一つを含む生体親和性材料から構成されていることが好ましい。なお、プロテオグリカンは、タンパク質と糖鎖（グリコサミノグリカン）が共有結合した複合糖質の一種である。また、細胞外基質は、熱可塑性高分子等の高分子体で作製された数平均直径が１ｎｍ～１０００ｎｍのナノファイバーからなるスポンジ状の三次元構造体も使用できる。そのような三次元構造体の空隙率は８０％～９９．９９％とすることが好ましい。
　細胞外基質として使用されるコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合であるＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンを用いることが好ましい。Ｉ型コラーゲンとは、基本的コラーゲンであり、線維性コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンは、コラーゲン線維とは別の、細網線維と呼ばれる細い網目状の構造を形成し、細胞等の足場を作ることができる。
　上述の混合コラーゲンを用いる場合には、ＩＩＩ型コラーゲンの割合は１０重量％以上５０重量％以下とすることが好ましい。ＩＩＩ型コラーゲンの割合が５０重量％よりも多くなると、混合コラーゲンが固化できないおそれがあるからである。一方、ＩＩＩ型コラーゲンの割合が１０重量％よりも少なくなると、Ｉ型コラーゲンの割合が多くなり、後述するような血管新生が起こるのではなく、象牙質が再生される可能性があるからである。
　次に、図２を用いて、本実施形態に係る根管充填材２００の製造方法を説明する。
　根管充填材２００は、細胞外基質２１０の根尖側に歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を付着させて形成される。間葉系幹細胞２２０は根管充填材２００の根尖部の１／４～２／３に付着されているのが望ましく、より望ましくは根尖部の１／３である。根管充填材は、流体状の細胞外基質を用いる場合には、細胞外基質と間葉系幹細胞とを含む第１の組成物と、細胞外基質を含む第２の組成物とを調製し、これらがそれぞれ、根尖部、歯冠部に位置するように形成することができる。製造方法の一具体例としては、まず、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に１０μリットル～１３μリットルのＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンを吸い込み、次に、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞を混合させたＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲン（例えばコラーゲンＸＹＺ（新田ゼラチン））を７μリットル～１０μリットル吸い込むことができる。ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。根管充填材内部に気泡が発生すると、発生した気泡が細胞の遊走を妨げて歯組織再生の促進が損なわれるからである。ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましく、例えばチップの下内径が０．５～０．７ｍｍのものが使用でき、例えばＱＳＰ社のＨ－０１０－９６ＲＳマイクロキャピラリーチップを使用できる。根管充填材の形状は、特に限定されるものではなく、例えば円錐、円錐台、円柱等である。あるいは、根管充填材は、スポンジ状の三次元構造体の細胞外基質を用いる場合には、歯根に適合するサイズに形成された、細胞外基質を含む構造体の根尖部に歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞を吸収させて調製することができる。なお、本実施形態の説明における上記細胞外基質の使用容量は、一例であって、充填材は特定の容量には限定されず、歯髄を再生させる歯の根管の容量に応じて、適宜決定することができる。
　次に、図３Ａ～図３Ｆを用いて、根管充填材２００を使用する非抜歯法による歯組織再生方法を、歯組織再生方法の一例として説明する。
　本実施形態に係る歯髄組織再生方法は、図３Ａに示すように、例えば歯髄炎が発生している対象となる歯１００について、非抜歯にて歯組織再生を行う。対象となる歯とは、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯をいう。
　対象となる歯１００について、図３Ｂに示すように、抜髄又は感染根管の根管拡大清掃が行われる。抜髄とは、歯牙の内部に存在する歯髄を除去することである。抜髄は当業者には既知の通常の方法、たとえば、手用あるいは電気エンジンのリーマー・ファイルあるいはロータリーエンジンで器械的に拡大形成後、次亜塩素酸ソーダとオキシドールで交互洗浄する方法によって行うことができる。また、感染根管とは、細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質に及んでいる場合の根管をいい、根管拡大清掃後とは、感染根管における細菌を除去した後をいう。細菌の除去は、たとえば、交互洗浄後、根管内薬剤塗布によって行うことができる。
　抜髄後は、対象となる歯の根管を拡大し、根尖部の根管の大きさを所定の太さにすることが望ましい。抜髄あるいは感染根管治療した根管内に根管充填材２００を充填する際に、根管を拡大しておくほうが根管充填材２００を充填しやすいためである。また、根尖歯周組織から血管及び神経が進入しやすいためである。ここで、根尖とは、対象となる歯の歯槽骨に結合される端部（歯根の先端部分）をいう。歯の根管の拡大は、手用あるいは電気エンジンのリーマー・ファイルあるいはロータリーエンジンで器械的にという方法によって行うことができる。
　例えば、図３Ｂにおいて、根尖部の根管の太さｄは、根管の直径において０．６ｍｍ以上、１．５ｍｍ以下とすることが望ましい。根管の太さｄが０．６ｍｍよりも小さいと、血管及び神経が根尖歯周組織から進入しにくく、また根管充填材２００の充填が難しいおそれがあるからである。一方、根管の太さが１．５ｍｍよりも大きいと、対象となる歯に対して必要以上の負担を与えて割れやすくなるおそれがあるからである。
　次に、図３Ｃに示されるように、根管の根尖側にピンセット等により根管充填材２００を充填する。根管充填材２００は、生物学的材質を含有するので、生物学的根管充填材とすることもできる。根管充填材２００は、根管内の歯髄が存在した場所である歯髄相当部位に充填することが望ましい。なお、細胞外基質２１０がゲル状の場合はピンセット等でつまむことができないので、ピペットマン、注射等により注入することができる。
　根管の根尖側に根管充填材２００を注入した後は、図３Ｄに示されるように、根管充填材２００の上部にゼラチン６１０を注入し、レジン６２０により蓋をすることができる。ゼラチン、及びレジンは、特に限定されることなく、歯科治療で通常使用されるものを用いることができる。
　これにより、根管内の歯組織が再生される。再生される歯組織は、図３Ｅに示されるように、例えば根管内の歯髄固有組織、血管４００、神経等である。また、ＢＭＰｓ等の形態形成因子を用いることにより、再生される歯組織としては象牙質がある。更に、感染根管に対して根管充填材２００を充填する場合は、再生される歯組織として歯根膜（歯槽骨に歯を植立する歯周組織）やセメント質等の歯周組織がある。
　その後は、レジン６２０を一度除去して、図３Ｆに示すように、ＢＭＰｓ等の形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布し、レジン６２０により蓋をする。形態形成因子６３０又は象牙質形成因子を歯冠部歯髄に塗布したことにより、図３Ｇに示されるように象牙質５００も再生することができる。
　更に、本実施形態に係る根管充填材２００を用いる歯組織再生では、再生組織に内部吸収及び外部吸収が見られず、且つ、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいる。また、出血による血餅が多量に存在すると歯髄組織再生の障害になると考えられるところ、非抜歯の方法では、血餅の発生を低く抑えられ、効率的に歯組織再生を促進させることができるという利点がある。また、根管拡大後の出血や症状が消失するまで根管貼薬して根管充填を待つことができ、実際の臨床治療に近接させることができるという利点もある。
　なお、上述したように、対象となる歯１００は、う蝕、歯髄炎等により、細菌感染が冠部歯髄又は根部歯髄まで波及している歯であってよいが、これに限定されない。すなわち、対象となる歯１００には神経機能が低下して咬合感覚が弱くなっている歯も含まれる。このような場合は、抜髄後に、根管に根管充填材２００を充填することにより、歯髄を再生させることで咬合感覚を向上させることができる。また、図３Ｈに示すように、対象となる歯１００には、細菌感染が根尖歯周組織まで波及している歯（細菌が歯髄に到達後、根管壁の象牙質及び根尖歯周組織に及んでいる歯）も含まれる。このような歯は根尖性歯周炎１１０を伴うことが多い。感染根管の根管拡大清掃後に、根管充填材２００を注入することが好ましい。
　本実施形態による根管充填材は、非抜歯のみならず、抜歯の形態でも同様に用いることができる。抜歯の形態で用いる場合には、ます、歯組織再生が所望される対象を、抜歯する。抜歯後、感染根管の根管拡大清掃後、抜髄及び消毒する。抜髄及び消毒は、上記非抜歯の方法で説明したのと同様にして行うことが出来る。次に、根尖部を切断して開口して根管充填材を移植する。根尖部の切断箇所は、下端から１ｍｍ～２ｍｍが好ましい。根尖部の切断方法は、歯科的な通常の方法、例えば、エアタービンや電気エンジンによることができる。根管充填材の注入は、上記非抜歯の方法で説明したのと同様にして行うことが出来る。図３Ｉは、抜歯の形態における、根管の根尖側への根管充填材２００の充填を示す根管充填材を注入した後は、根管充填材の上部にゼラチンを注入し、レジンにより蓋をする。その後は抜歯をした歯を抜歯窩に再移植することができる。抜歯の形態は、特に直視で患歯を処置できることおよび根尖部歯周組織に傷害が少ないという利点がある。
　（第２実施形態）
　第２実施形態に係る根管充填材は、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞と、遊走因子とを含む。遊走因子は、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む。
　図４（ａ）及び（ｂ）は、本発明の第２実施形態に係る根管充填材２００の説明図である。図４（ａ）に示すように、根管充填材２００は、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側（例えば根管の上部１／２～２／３）に細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子２３０を付着させている。
　間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させ、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる理由は、間葉系幹細胞２２０を根管の歯冠側にまで付着させても組織からの栄養が供給されずに壊死する可能性があるからであり、また、根管の根尖側に付着している間葉系幹細胞２２０が根管の歯冠側に付着している遊走因子に引っぱられて歯組織再生が促進されやすいからである。なお、図４（ｂ）に示すように、根管充填材２００の根管の歯冠側に細胞外基質２１０を残しておくことも可能である。
　遊走因子は、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち一つを含むものであってもよく、二以上を組み合わせて含むものであってもよい。
　細胞遊走因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の遊走に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。また、細胞増殖因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の増殖に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。そして、神経栄養因子とは、それが受容体に結合することによって細胞の生存に関わる信号伝達系が活性化する分子を意味する。
　細胞遊走因子は、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ、ＧＭ－ＣＳＦ、及び血清のうち少なくともいずれか一つを用いることが好ましい。特に、ＭＭＰ３は、細胞遊走能が高く好適に使用することができる。
　細胞増殖因子は、ＩＧＦ，ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及び血清の少なくともいずれか一つを用いることが好ましい。
　神経栄養因子は、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３及び血清のうち少なくともいずれか一つを用いることが好ましい。血清は、自己血清が好ましい。自己血清とは、歯組織再生を受ける個体の血清であって、新鮮な血液を３０分静置させた後、遠心させて上清を集めることにより得ることができる。
　遊走因子を付着させた細胞外基質における、遊走因子の含有率は、０．１ｎｇ／μｌ以上５００ｎｇ／μｌ以下とすることが好ましい。遊走因子の含有率が０．１ｎｇ／μｌよりも少ないと、遊走の程度が少なくなる可能性がありうるからである。一方、遊走因子の含有率が５００ｎｇ／μｌよりも多いと、対象となる歯１００に対して予期せぬ副作用が生じる可能性があり得るからである。
　次に、図５を用いて、本実施形態に係る根管充填材２００の製造方法を説明する。図５は、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させる根管充填材２００の製造方法を説明する説明図である。
　実施形態２に係る根管充填材２００は、流体状の細胞外基質を用いる場合には、細胞外基質と歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞とを含む第１の組成物と、細胞外基質と遊走因子とを含む第２の組成物とを調製し、これらがそれぞれ、根尖部、歯冠部に位置するように注入、移植することができる。製造方法の一具体例としては、まず、トータルで２０μリットルとし、ピペットマンのチップ等に遊走因子を混合させたＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲン（Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンとの混合割合は１：１）を１０μリットル～１３μリットル吸い込む。次に、間葉系幹細胞を混合させたＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンを７μリットル～１０μリットル吸い込む。実施形態２においても、ピペットマンのチップ等に吸い込む際には気泡が発生しないように吸引速度は緩やかにすることが好ましい。また、ピペットマンのチップの内径は細いものが好ましい。このようにして、図４（ａ）に示す根管充填材２００が製造される。
　実施形態２に係る根管充填材２００の使用形態は、実施形態１と同様に、抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の非抜歯の根管の根尖側、あるいは、抜歯後、根尖部を切断して開口した根管の根尖側に充填することができる。
　本実施形態に係る根管充填材２００によれば、遊走因子を有しているため更に効率的に、歯組織再生を行うことができ、再生組織には、内部吸収は無く、破歯細胞も見られずに、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並んでいる。
（第３実施形態）
　上述の第１実施形態では、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０が根管充填材２００の根管の根尖側に付着されて根管充填材２００は構成されていた。しかし、そのような実施形態に限定されることはなく、間葉系幹細胞２２０は、根管充填材２００の全体に均一に混合されていても良い。このような根管充填材２００も、抜歯もしくは非抜歯の両方の形態で同様に使用することができ、これを使用することにより、歯根完成歯に対して、内部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。このような根管充填材２００は、例えば、間葉系幹細胞２２０と、細胞外基質の一例であるＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンとを気泡を発生させないように均一に混合させることにより製造される。
　また、上述の第２実施形態では、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させるとともに、根管の歯冠側に遊走因子２３０を付着させて、根管充填材２００は構成されていた。しかし、そのような実施形態に限定されることはなく、間葉系幹細胞２２０及び遊走因子２３０は共に、根管充填材２００の全体に均一に混合されていても良い。このような根管充填材２００も、抜歯もしくは非抜歯の両方の形態で同様に使用することができ、これを使用することにより、歯根完成歯に対して、内部吸収を発生させず、破歯細胞が見られず、象牙質壁に象牙芽細胞が滑らかに並ぶ歯組織再生を図ることができる。この根管充填材２００は、例えば、間葉系幹細胞と、遊走因子と、細胞外基質の一例であるＩ型・ＩＩＩ型混合コラーゲンとを気泡を発生させないように均一に混合させることにより製造される。
（第４実施形態）
　本願発明は、第４実施形態によれば、上記第１～第３の実施形態において説明した根管充填材を用いた歯組織の異所再生方法である。歯組織の異所再生方法は、第１の個体の歯の抜髄を行う工程と、前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程と、前記根管に、前述の根管充填材を注入する工程と、充填材を注入した歯根を第２の個体に移植する工程とを含む。
　根管充填材は、上記第１～第３の実施形態において説明したものを用いることができる。しかし、上記第１～第３の実施形態における根管充填材を構成する間葉系幹細胞に替えて、歯髄幹細胞を用いることもできる。この場合、歯髄ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＳＳＥＡ－４陽性細胞、ＦＬＫ－１陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、歯髄ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞及びＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１６６陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことが好ましく、前記歯髄ＳＰ細胞が、ＣＸＣＲ４陽性、ＳＳＥＡ－４陽性、ＦＬＫ－１陽性、ＣＤ３１陰性かつＣＤ１４６陰性、ＣＤ２４陽性、ＣＤ１０５陽性、ＣＤ１５０陽性、ＣＤ７３陽性、又は、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１６６陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含むことが好ましい。
　上記第１の個体は、歯を再生することを所望する個体であって、哺乳動物が好ましく、典型的にはヒトである。上記第２の個体は、第１の個体と異なり、ヒトを除く哺乳動物である。たとえば、マウスやブタであってよく、免疫不全化したマウスやブタを用いることができる。
　第４実施形態にかかる方法を、図６を用いて説明する。図６（ａ）は、第１の個体の歯１００である。本実施形態に用いる第１の個体の歯は、第１の個体から抜歯することによって得ることができる。第１の個体の歯の抜髄を行う工程では、第１実施形態で説明したのと同様に、抜髄を行う。図６（ｂ）は、抜歯され、歯髄が除去された歯１００である。前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程では、再生させる組織の大きさに応じて、歯の歯根部分を切り出す。例えば、１～３０ｍｍとすることができるが、これらには限定されない。図６（ｃ）は、切り出される歯根部分１２０を模式的に示したものである。抜髄後の根管の一端を封鎖する工程では、切り出した歯根部分１２０の根管の一端を、セメント等を用いて封鎖する。前記根管に、前述の根管充填材を注入する工程では、第１～第３実施形態で説明した方法に従って充填材を調製し、注入する。図６（ｄ）は、根管充填材２００を歯根部分１２０の根管に注入した状態を示す。根管充填材２００は、間葉系幹細胞２２０を根管の根尖側に付着させる。図６（ｅ）は、根管充填材が注入された歯根部分７００を示す。根管充填材２００を注入した歯根を第２の個体に移植する工程では、図６（ｆ）に示すように、根管充填材２００を注入された歯根部分７００を、第２の個体の、好ましくは皮下に移植する。
　その後、第２の個体を所定の期間にわたって飼育し、前記根管充填材が充填された歯根部分７００を取り出すことで、再生された歯組織を得ることが出来る。再生された歯組織は、さらに、第１の個体の歯槽骨内に再移植して用いることができる。第４実施形態にかかる方法は、ある個体の歯組織を、別の個体で再生することができる点で非常に有利でありうる。　
　以下に、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例によって何ら限定されるものではない。
　［イヌ由来幹細胞による歯髄の再生］
　［細胞分離］
　イヌ上歯から抽出したイヌ歯髄組織より、Iohara et al., 2006（STEM CELLS, Volume 24, Issue 11, pages 2493-2503, November 2006）に記載の方法により、イヌ歯髄幹細胞を分取した。初代脂肪細胞及び初代骨髄細胞は、それぞれ、同一のイヌの腹部皮下脂肪及び肋骨の骨髄から分離した。これらの細胞は、Iohara et al., 2006に記載されているように、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，http://www.sigmaaldrich.com）でラベルした。そして、この細胞を、マウスＢＤ　Ｆｃ　Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ，http://www.bdbioscience.com）で３０分間、４℃でプレインキュベートし、非特異的結合を除去した。これらの細胞を、さらに、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＭＣＡ９２８）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ　Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，http://www.serotec.com）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＰＥ）（ＭＣＡ９２８ＰＥ）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、および、２０％ウシ胎児血清を添加した、ＰＢＳ中の、マウス抗ブタＣＤ３１（ＰＥ）（ＬＣＩ－４）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，http://www.invitrogen.com）で６０分間、４℃でインキュベートした。そして、これらを、２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＨＥＰＥＳバッファー中で再懸濁させた。細胞の分析及びソーティングは、フローサイトメータ（ＦＡＣＳ－ＡＲＩＡ　ＩＩ（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて行った。
　イヌ歯髄、骨髄及び脂肪細胞由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞を、Ｉ型コラーゲンでコートした３５ｍｍ皿（Ａｓａｈｉ　Ｔｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ　ｃｏｒｐ．，Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，Ｊａｐａｎ，http://www.atgc.co.jp）中の、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）にそれぞれ播種し、細胞を維持した。培地は、４～５日に一度交換した。細胞が、５０～６０％コンフルエントに達したら、０．０２％のＥＤＴＡで３７℃、１０分間インキュベートすることにより分離し、１：４に希釈して、継代培養した。
　［細胞表面マーカーの発現］
　イヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の表現型を第３継代において評価した。細胞は、以下のもので免疫標識した。マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ　Ｌｔｄ．）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）（ＭＣＡ９２８Ｆ）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－Ｃｙ５，ＰＥ－Ｃｙ５）（ＭＣＡ９２８Ｃ）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ａｌｅｘａ　６４７）（ＭＲＣ　ＯＸ－３４）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ２４（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７）（ＭＬ５）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２９（ＰＥ－Ｃｙ５）（ＭＥＭ－１０１Ａ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３１（ＦＩＴＣ）（Ｑｂｅｎｄ１０）（Ｄａｋｏ）、ＣＤ３３（ＦＩＴＣ）（ＨＩＭ３－４）（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３４（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＡＰＣ）（１Ｈ６）（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）、ＣＤ４４（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－Ｃｙ７、ＰＥ－Ｃｙ７）（ＩＭ７）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ７３（ＡＰＣ）（ＡＤ２）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ９０（ＦＩＴＣ）（ＹＫＩＸ３３７．２１７）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ１４６（ＦＩＴＣ）（ｓｃ－１８８３７）（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ１５０（ＦＩＴＣ）（Ａ１２）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＭＨＣクラスＩ（Ｒ－ＰＥ）（３Ｆ１０）（Ａｎｃｅｌｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂａｙｐｏｒｔ，ＭＮ，ＵＳＡ）、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩＩ（ＡＰＣ）（ＴＤＲ３１．１）（Ａｎｃｅｌｌ）、ＣＸＣＲ４（ＦＩＴＣ）（１２Ｇ５）（Ｒ＆Ｄ）に対する抗体。
　［リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析］
　細胞集団のさらなる表現型を評価するために、第３継代において歯髄および脂肪ＣＤ１０５＋細胞、及びｔｏｔａｌ歯髄細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。細胞数は、各実験とも、５×１０４にノーマライズした。Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ合成は、ｔｏｔａｌＲＮＡから、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ－α（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて逆転写することによって行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ増殖は、ライトサイクラーＦａｓｔ　Ｓｔａｒｔ　ＤＮＡ　ｍａｓｔｅｒ　ＳＹＢＲ　ＧｒｅｅｎＩ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，　Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）で標識した幹細胞マーカーである、ｃａｎｉｎｅ　ＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ２、Ｓｔａｔ３、Ｂｍｉ１、Ｔｅｒｔ、Ｏｃｔ４を用いて、９５℃で１０秒，６２℃で１５秒、７２℃で８秒、ライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。用いたプライマーを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　血管新生因子及び神経栄養因子のｍＲＮＡの発現を調べるために、イヌマトリックスメタロプロテアーゼ－３（ＭＭＰ－３）、ＶＥＧＦ－Ａ、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＳＤＦ－１、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ増殖もまた行った（Iohara et al.,submitted）。骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の発現は、ベータアクチンで正規化した後、歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞の発現と比較した。
　［分化誘導］
　第３継代から第５継代のイヌ骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の血管新生細胞及び神経栄養細胞への分化は、Iohara et al., 2006に記載した歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞の分化と比較した。神経分化については、ニューロフィラメント、ニューロモジュリン、及びｓｏｄｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ，ｖｏｌｔａｇｅ－ｇａｔｅｄ，ｔｙｐｅＩα（Ｓｃｎ１α）の発現を調べた。
　［増殖及び遊走アッセイ］
　間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）（Ａｃｒｉｓ，Ｈｅｒｆｏｒｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に応答した細胞増殖を決定するために、第４継代のイヌ骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞と歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞を、０．２％のウシ胎児アルブミン（Ｓｉｇｍａ）及びＳＤＦ－１（５０ｎｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、９６ウェルあたり、１０３ｃｅｌｌｓの条件で比較した。１０μｌのＴｅｔｒａ－ｃｏｌｏｒ　ｏｎｅ（登録商標）（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ　Ｋｏｇｙｏ，Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ）を９６ウェルプレートに添加し、培養開始後、２、１２、２４、３６時間において、分光光度計を用いて波長４５０ｎｍの吸光度を測定し、細胞数を得た。細胞を入れないウェルをネガティブコントロールとして用いた。
　歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞と比較した骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の遊走活性を調べるために、ＳＤＦ－１、ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ　ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓアッセイを行った。ＴＡＸＩＳｃａｎ－ＦＬ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ）を用いて、細胞のリアルタイムｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ　ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓを検出した。ＴＡＸＩＳｃａｎ－ＦＬは、エッチングしたシリコン基板と、平坦なガラスプレートから構成され、両者は、６μｍの深さのマイクロチャネルを有する二つのコンパートメントを形成する。各細胞フラクション（１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌを、１μｌ）は、ステンレススチールホルダを備えたデバイスが結合した単一の孔に注入した。１０ｎｇ／μｌのＳＤＦ－１、１μｌは、反対側の孔に注入した。細胞遊走のビデオ画像を６時間にわたって撮影した。
　［インビボ移植］
　歯髄の除去及び細胞集団の移植の実験モデルは、歯根が完全に完成しており根管が閉鎖しているイヌ永久歯（Ｎａｒｃ，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）において確立した。両側の上顎第二門歯及び下顎第三門歯において、静脈内にペントバルビタールナトリウム（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ－Ｐｌｏｕｇｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を注入して全歯髄を除去した後、＃７０Ｋ－ｆｉｌｅ（ＭＡＮＩ．ＩＮＣ，Ｔｏｃｈｉｇｉ，Ｊａｐａｎ）を用いて、根尖部の根管の太さを０．７ｍｍ以上にした。第３継代から第４継代におけるイヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の、それぞれ５ｘ１０５ｃｅｌｌｓをコラーゲンＴＥ（新田ゼラチン）１０μｌでＤｉＩラベルした第１の組成物と、コラーゲンＴＥ１０μｌと最終濃度が１５ｎｇ／μｌのＳＤＦ－１を含む第２の組成物とから構成される、根管充填材を調製した。この充填材を、第１の組成物が下部根管に自家移植され、かつ第２の組成物が上部根管にあるように、根管に充填した。充填後、上部の孔はリン酸亜鉛セメント（Ｅｌｉｔｅ　Ｃｅｍｅｎｔ，ＧＣ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）及び複合レジン（Ｃｌｅａｒｆｉｌ　Ｍｅｇａ　Ｂｏｎｄ，Ｋｕｒａｒａｙ）で封鎖し、接着剤(Ｃｌｅａｒｆｉｌ　ＭｅｇａＢｏｎｄ，Ｋｕｒａｒａｙ)で処理した。１５匹のイヌからの６０の歯を使用した。各１０の歯に、歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞とＳＤＦ－１を移植し、１４日後及び２８日後に採取した。
　形態学的分析のために、これらを４％のパラホルムアルデヒドＰＦＡ）（Ｎａｋａｒａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で、４℃において一晩固定し、１０％のギ酸で脱塩した後、パラフィンワックス（Ｓｉｇｍａ）に埋め込んだ。パラフィンのセクション（５μｍ厚さ）は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した後、形態学的分析を行った。血管の染色のため、５μｍ厚さのパラフィンのセクションは、脱パラフィンし、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ１／ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｇａｌａｎｔｈｕｓ　ｎｉｖａｌｉｓ（ｓｎｏｗｄｒｏｐ）ｌｅｃｔｉｎ（２０μｇ／ｍｌ，Ｖｅｃｔｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙｏｕｎｇｓｔｏｗｎ，Ｏｈｉｏ）で１５分間染色し、移植した細胞の存在及び局在化を新しく形成された血管との関連でモニターした。モニターには、蛍光顕微鏡ＢＩＯＲＥＶＯ，ＢＺ－９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
　次に、神経染色のために、５μｍ厚さのパラフィンのセクションは、脱パラフィンし、０．３％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともに、１５分間インキュベートした。２．０％のｎｏｒｍａｌ　ｇｏａｔ　ｓｅｒｕｍとともにインキュベーションして、非特異的結合をブロックした後、ヤギ抗ヒトＰＧＰ９．５（Ｕｌｔｒａ　Ｃｌｏｎｅ　Ｌｔｄ．）（１：１００００）とともに、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、結合した抗体は、ビオチン化ヤギ抗ウザギＩｇＧ二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ）（１：２００）と、室温にて１時間反応させた。このセクションはまた、ＤＡＢ　ｃｈｒｏｍｏｇｅｎを用いて、ＡＢＣ　ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともに、１０分間展開した。
　移植１４日後の各サンプルにおける再生歯髄の相対量は、実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ，Ｍ２０５ＦＡ）での歯の全体画像を得ることにより測定した。イヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞及びＳＤＦ－１を移植したそれぞれ５本ずつの各歯について、１５０μｍの間隔をおいた３つのセクションを調べた。新たに再生された歯髄組織及び象牙質のスクリーンの映像の輪郭を追跡し、根管におけるこの輪郭の表面積を、Ｌｅｉｃａ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｕｉｔｅ　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて決定した。根管面積に対する再生面積の比率は、各歯の３つのセクションにおいて計算し、平均値を決定した。統計的分析は、ｕｎｐａｉｒｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いて行った。データは、５回の測定の平均±標準偏差であらわした。
　リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ増殖は、３つの異なる細胞移植における再生組織の比較のために、歯根膜については、前述のマーカー、すなわちイヌａｘｉｎ２、ペリオスチン、アスポリン／ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　ｌｉｇａｍｅｎｔ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１　（ＰＬＡＰ－１）、シンデカン３、テネイシンＣ、ＴＲＨ－ＤＥ、ビメンチン、アルカリホスファターゼもまた用いて行った。
　［統計的分析］
　平均値±標準偏差であらわされたデータは、ｕｎｐａｉｒｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔを用いて計算した。各実験は３回行い、典型的結果を図表に記した。
　［結果］
　［イヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の単離及び評価］
　フローサイトメトリーによる分析の結果、同一個体からのイヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、１．５％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図７（ａ）、（ｅ）、（ｉ））。また、イヌ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、０．９％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図７（ｂ）、（ｆ）、（ｊ））。これら３種類のＣＤ３１－ＳＰ細胞集団は、同様の細胞表現型、すなわち複数の長い突起を有する星状細胞および紡錘状細胞を含むものであった。星状細胞は顆粒に囲まれた大きな核を含有するものであった。紡錘状細胞は、細長い突起とわずかな細胞質を有するニューロン様の細胞であった。図７（ｃ）、（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｋ）、（ｌ）に示す。３５ｍｍ皿に播種した、単一のイヌ歯髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞は、１０日間でコロニーを形成し、単一のイヌ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞は、１４日間でコロニーを形成した。この結果は、これらの細胞に、コロニー形成活性があることを示す。イヌ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の付着および増殖の効率はそれぞれ、８％、６％、７％であると推定された。第３継代における限界希釈法アッセイの結果、歯髄ＣＦＵの頻度は、イヌ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞においては８０％と推定され、イヌ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞においては７５％と推定され、イヌ脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞においては８０％と推定された。
　細胞表面抗体マーカーのフローサイトメトリー分析により、イヌ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞の「幹細胞としての形質」を、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞と比較した。これら三種のＣＤ３１－ＳＰ細胞集団は、ＣＤ２９、ＣＤ４４、およびＣＤ９０について陽性であった。ＣＤ３４＋細胞の割合は、イヌ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞では、４．４％であり、これはイヌ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞の９．８％、イヌ脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の７．１％と比較して低いものであった。ＣＤ１０５＋細胞の割合は、イヌ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞では、６０．２％であり、イヌ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞では６４．９％であり、イヌ脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の８５．５％と比較して低いものであった。これらは第４継代において、ＣＤ１４６についてはおおむね陰性であった。ＣＸＣＲ４は、イヌ歯髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞において、イヌ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞よりも多く発現していた。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　幹細胞マーカーであるＳｔａｔ３、Ｂｍｉ１、Ｓｏｘ２、Ｔｅｒｔ、ＣＸＣＲ４は、イヌ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞において、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞と同程度に発現していた。この結果は、これら３種の細胞集団が、同程度の幹細胞としての性質を有していることを示唆する。血管新生因子および／または神経栄養因子である、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＭＭＰ－３の発現量は、イヌ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞においては、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞におけるよりも、多かった。ＢＤＮＦは、イヌ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞において、イヌ歯髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞におけるよりも多く発現した。ＧＤＮＦは三種の細胞集団でいずれも同様に発現した。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＣＤ３１－ＳＰ細胞の血管内皮細胞への分化能（図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ））、ニューロスフェアへの分化能（図８（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））、神経細胞への分化能（図８（ｇ）、（ｈ）、（ｉ））を、イヌ歯髄、骨髄、及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の三種の細胞集団において比較した。索状および管状の広範囲のネットワークが、すべての細胞集団において、培養１２時間までにはマトリゲル上で観察された（図８（ａ）、（ｂ）、（ｃ））。クラスターおよび増殖性のニューロスフェアが培養開始後１４日において検出された。三種の細胞集団においては、ニューロスフェアの頻度および量においては、大きな相違は見られなかった。そして、これらのニューロスフェアからのさらなる神経誘導にも成功した。これら三種の細胞集団におけるほとんどの細胞は、免疫染色によりニューロモジュリン陽性であった。神経マーカー、ニューロフィラメント、ニューロモジュリン、Ｓｃｎ１α ｍＲＮＡは三種の細胞集団のすべてにおいて発現していた（図８（ｊ））。
　［遊走と増殖］
　ＴＡＸＩＳｃａｎ－ＦＬにより示されるＳＤＦ－１を加えた場合の遊走活性は、イヌ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞において比較的高く、イヌ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞においては、これら二つよりも低いものであった（図９（ａ））。また、ＳＤＦ－１を加えた場合の増殖活性も、イヌ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞と、イヌ骨髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞において、いずれも同様であった（図９（ｂ））。
　［根管への移植後の歯髄再生］
　次に、イヌ歯髄、骨髄、および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞とＳＤＦ－１との、歯根が完全に完成しており根管が閉鎖しているイヌ永久歯の抜髄後の根管への、ｉｎ　ｖｉｖｏでの自家移植を評価した（図１０）。歯髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の移植の結果、ＳＤＦ－１とともに移植した場合には、移植後１４日目には、歯髄様組織の形成が生じた（図１０（ａ）、（ｃ））。しかし、骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞とＳＤＦ－１とを移植した場合には、再生した歯髄の量は、歯髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞とＳＤＦ－１を移植した場合よりも少なかった（図１０（ｂ））。統計解析の結果、再生された領域は、歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞をＳＤＦ－１とともに移植した場合に、骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞をＳＤＦ－１とともに移植した場合と比較して、それぞれ、２．０倍、及び１．５倍であり、有意に大きいことがわかった（図１０（ｊ））。三種類のすべての移植において、再生された組織中の細胞は星状、あるいは紡錘状であった（図１０（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））。しかし、線維性の基質形成が、骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞移植の一部においてみられた（図１０（ｅ）、（ｆ））。さらに、脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞とＳＤＦ－１移植の９０日目には、歯髄内に強い石灰化が見られた（図１０（ｉ））が、歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞とＳＤＦ－１移植ではほとんど石灰化がみられず、骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞とＳＤＦ－１移植ではやや石灰化がみられた。凍結切片をＢＳ－１　ｌｅｃｔｉｎで染色した後に共焦点レーザー顕微鏡分析を行ったところ、再生組織において血管新生が生じていることがわかった（図１０（ｋ）（ｌ）（ｍ））。抗体で染色された神経突起は、根尖孔から新たに再生された歯髄内に延びていた（図１０（ｎ）（ｏ）（ｐ）。マッソン染色の結果、脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞とＳＤＦ－１移植の９０日目では強い基質形成がみられた。
　ペリオスチンｍＲＮＡの発現は、イヌ歯髄、骨髄、及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞移植の再生組織において、正常な歯根膜組織における発現量よりも、ずっと少なかった。歯髄で多く発現することが知られている、シンデカン３、テナスチンＣ、ビメンチンは、すべての再生組織においても、正常な歯髄組織と比較して、同様に発現していることがわかった。脂肪、骨、象牙質、ａＰ２、Ｏｓｔｅｒｉｘ、Ｄｓｐｐの分化マーカーは、それぞれ、いずれの再生組織においても発現していなかった。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　［ブタ由来幹細胞による歯髄の再生］
　［細胞分離］
　初代歯髄細胞は、ブタ歯胚から分離した。ブタ初代脂肪細胞及び初代骨髄細胞は、それぞれ、同一のブタの下顎から分離した。これらの細胞は、Iohara et al., 2006に記載されている方法にしたがい、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，http://www.sigmaaldrich.com）でラベルした。そして、この細胞を、マウスＢＤ　Ｆｃ　Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ，http://www.bdbioscience.com）で３０分間、４℃でプレインキュベートし、非特異的結合を除去した。これらの細胞を、さらに、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＭＣＡ９２８）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ　Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，http://www.serotec.com）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ，ＰＥ）（ＭＣＡ９２８ＰＥ）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、および、２０％ウシ胎児血清を添加した、ＰＢＳ中の、マウス抗ブタＣＤ３１（ＰＥ）（ＬＣＩ－４）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，http://www.invitrogen.com）で６０分間、４℃でインキュベートした。そして、これらを、２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ）を含有するＨＥＰＥＳバッファー中で再懸濁させた。細胞の分析及びソーティングは、フローサイトメータ（ＦＡＣＳ－ＡＲＩＡＩＩ（ＢＤ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて行った。
　ブタ歯髄、骨髄及び脂肪細胞由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞を、Ｉ型コラーゲンでコートした３５ｍｍ皿（Ａｓａｈｉ　Ｔｅｃｈｎｏｇｌａｓｓ　ｃｏｒｐ．，Ｆｕｎａｂａｓｈｉ，Ｊａｐａｎ，http://www.atgc.co.jp）中の、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）及び５ｎｇ／ｍｌ　ＥＧＦ（Ｃａｍｂｒｅｘ　Ｂｉｏ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）を添加したＥＢＭ２にそれぞれ播種し、細胞を維持した。培地は、４～５日に一度交換した。細胞が、５０～６０％コンフルエントに達したら、０．０２％のＥＤＴＡで、３７℃、１０分間インキュベートすることにより分離し、１：４に希釈して、継代培養した。
　［細胞表面マーカーの発現］
　ブタ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の表現型を第３継代において評価した。細胞は、下記の抗体で免疫標識し、フローサイトメトリーで分析した。マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ　Ｌｔｄ．）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，ＦＩＴＣ）（ＭＣＡ９２８Ｆ）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ－Ｃｙ５，ＰＥ－Ｃｙ５）（ＭＣＡ９２８Ｃ）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、マウスＩｇＧ１ネガティブコントロール（Ａｌｅｘａ　６４７）（ＭＲＣ　ＯＸ－３４）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、及び、ＣＤ１４（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　６４７）（ＴｕＫ４）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ２９（ＰＥ－Ｃｙ５）（ＭＥＭ－１０１Ａ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ３１（ＰＥ）（ＬＣＩ－４）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ３４（ＰＥ）（５８１）（Ｂｅｃｋｍａｎ　ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＣＤ４４（ＰＥ－Ｃｙ５）（ＩＭ７）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ７３（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　６４７）（ＡＤ２）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ９０（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　６４７）（Ｆ１５－４２－１）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ１０５（ＦＩＴＣ）（ＭＥＭ－２２９）（ａｂｃａｍ）、ＣＤ１１７／ｃ－ｋｉｔ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ，ＡＰＣ）（Ａ３Ｃ６Ｅ２）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ　Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，http://www.miltenyibiotec.com）、ＣＤ１３３（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｏｕｒ　６４７）（２９３Ｃ３）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、ＣＤ１４６（ＦＩＴＣ）（ＯＪ７９ｃ）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ），ＣＤ１５０（ＦＩＴＣ）（Ａ１２）（ＡｂＤ　Ｓｅｒｏｔｅｃ），ＣＤ２７１（ＡＰＣ）（ＭＥ２０．４－１Ｈ４）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ．）、ＣＸＣＲ４（ＦＩＴＣ）（１２Ｇ５）（Ｒ＆Ｄ）に対する抗体。
　［幹細胞マーカー、血管新生因子及び神経栄養因子のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ解析］
　ブタ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞集団の幹細胞特性、血管新生能、神経原生能を調べるために、各ＣＤ３１－ＳＰ細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。細胞数は、各実験とも、５×１０４にノーマライズした。Ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ合成は、ｔｏｔａｌ　ＲＮＡから、ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ－α（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて逆転写することによって行った。リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ増殖は、ライトサイクラーＦａｓｔ　Ｓｔａｒｔ　ＤＮＡ　ｍａｓｔｅｒ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）で標識した幹細胞マーカー、ブタＣ　Ｓｏｘ２、Ｔｅｒｔ，Ｂｍｉ１，ＣＸＣＲ４、Ｓｔａｔ３、及び血管新生因子及び神経栄養因子、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、マトリックスメタロプロテアーゼ－３（ＭＭＰ－３）、血管内皮細胞増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｙ（Iohara et al., 2008（STEM CELLS, Volume 26, Issue 9, pages 2408-2418, September 2008）; Sugiyama et al., 2011（Tissue Engineering Part A. Jan 2011））を用いて、９５℃で１０秒、６２℃で１５秒、７２℃で８秒、ライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った．骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の発現は、ベータアクチンで正規化した後、歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞の発現と比較した。用いたプライマーを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　［歯根モデルへの移植］
　異所性の歯髄再生のために、ブタ歯根モデルの皮下移植を行った。ブタ第三切歯を抜歯し、その歯根を６ｍｍの長さにスライスした。根管を１ｍｍ幅にまで拡大した後、ＭＴＡセメントで一端を封鎖した。ブタ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞集団の第３から第４継代、それぞれ、１ｘ１０６ｃｅｌｌｓと、コラーゲンＴＥ（新田ゼラチン、Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）１０μｌから構成される根管充填材を調製した。この充填材を一端を封鎖した歯根に注入した。この歯根を、５週齢のＳＣＩＤマウス（ＣＢ１７，ＣＬＥＡ，Ｔｏｋｙｏ，ＪＡＰＡＮ，http://www.clea-japan.com）に皮下移植した。異なる４個体のブタ由来の歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞が、各２つの歯根に移植された。１４日後、組織学的研究のために、計２４本の歯根を採取した。
　形態学的分析のために、これらを４％のパラホルムアルデヒドＰＦＡ（Ｎａｋａｒａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で、４℃において一晩固定し、１０％のギ酸で脱塩した後、パラフィンワックス（Ｓｉｇｍａ）に埋め込んだ。パラフィンのセクション（５μｍ厚さ）は、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色した後、形態学的分析を行った。血管の染色のため、５μｍ厚さのパラフィンのセクションは、脱パラフィンし、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ（Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ）Ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ　Ｌｅｃｔｉｎ　１／ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ｇａｌａｎｔｈｕｓ　ｎｉｖａｌｉｓ（ｓｎｏｗｄｒｏｐ）ｌｅｃｔｉｎ（２０μｇ／ｍｌ，Ｖｅｃｔｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｙｏｕｎｇｓｔｏｗｎ，Ｏｈｉｏ）で１５分間染色し、移植した細胞の存在及び局在化を新しく形成された血管との関連でモニターした。モニターには、蛍光顕微鏡ＢＩＯＲＥＶＯ，ＢＺ－９０００（ＫＥＹＥＮＣＥ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用いた。
　［ブタ歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞の単離及び評価］
　フローサイトメトリーによる分析の結果、同一個体からの歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、１．６％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図１１Ａ（ａ）、１１Ｂ（ｅ）、１１Ｃ（ｉ））。また、歯髄、骨髄及び脂肪組織由来のＣＤ３１－ＳＰ細胞は、それぞれ全細胞の、０．９％、０．３％、０．１％で存在することがわかった（図１１Ａ（ｂ）、１１Ｂ（ｆ）、１１Ｃ（ｊ））。これら３種類のＣＤ３１－ＳＰ細胞集団は、同様の細胞表現型、すなわち複数の長い突起を有する星状細胞および紡錘状細胞を含むものであった。星状細胞は顆粒に囲まれた大きな核を含有するものであった。紡錘状細胞は、細長い突起とわずかな細胞質を有するニューロン様の細胞であった。図１１Ａ（ｃ）、Ａ（ｄ）、Ｂ（ｇ）、Ｂ（ｈ）、Ｃ（ｋ）、Ｃ（ｌ）に示す。ＩＧＦ１、ＥＧＦ、及び１０％のウシ胎児血清を添加したＥＢＭ２は、ＣＤ３１－ＳＰ細胞の表現型を保持していた。これは、第１２継代において、ＣＤ３１－及びＡＢＣＧ２／ＢＣＲＰ１＋が９９．８％より多いことを示す。コラーゲンタイプＩでコートされた３５ｍｍ皿に播種した、単一の歯髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞は、１０日でコロニーを形成し、単一の骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞は、１４日でコロニーを形成した。この結果は、これらの細胞にコロニー形成活性があることを示す。ブタ歯髄、骨髄及び脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の付着および増殖の効率はそれぞれ、８％，６％，７％であると推定された。第３継代における限界希釈法圧制の結果、歯髄ＣＦＵの頻度は、ブタ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞においては８０％と推定され、ブタ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞においては７５％と推定され、ブタ脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞においては８０％と推定された。
　細胞表面抗体マーカーのフローサイトメトリー分析により、ブタ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞の「幹細胞としての形質」を、ブタ骨髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞と比較した。これら三種のＣＤ３１－ＳＰ細胞集団は、第３継代において、ＣＤ２９、ＣＤ４４、およびＣＤ９０、ＣＤ１０５について陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ１４６については陰性であった。ブタ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞は、ブタ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞、ブタ脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞と比較して、はるかに多くのＣＤ３４を発現していた。ＣＸＣＲ４は、ブタ歯髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞において、ブタ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞よりも多く発現していた。結果を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　幹細胞マーカーであるＳｏｘ２、Ｔｅｒｔ、Ｂｍｉ１、ＣＸＣＲ４、Ｓｔａｔ３　ｍＲＮＡは、歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞において、骨髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞と同程度に発現していた。この結果は、これら３種の細胞集団が、同程度に幹細胞としての性質を有していることを示唆する。血管新生因子および／または神経栄養因子である、ＧＭ－ＣＳＦ、ＭＭＰ－３、ＶＥＧＦ－Ａ、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｙは、三種の細胞集団でいずれも同様に発現した。結果を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ＣＤ３１－ＳＰ細胞の内皮細胞への分化能（図１２（ａ）、（ｂ）、（ｃ））、ニューロスフェアへの分化能（図１２（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））を、三種のＣＤ３１－ＳＰ細胞集団において比較した。索状および管状の広範囲のネットワークが、すべての細胞集団において、培養１２時間目にはマトリゲル上で観察された（図１２（ａ）、（ｂ）、（ｃ））。クラスターおよび増殖性のニューロスフェアが培養開始後１４日において検出された。ニューロスフェアの頻度および量においては、三種の細胞集団間で、大きな相違は見られなかった。そして、これらのニューロスフェアからのさらなる神経誘導にも成功した。これらの結果は、三種の細胞集団のすべてが、同様の血管誘導及び神経誘導能を有することを示す。
　ＳＤＦ－１を加えた場合の増殖活性は、ブタ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞と、ブタ骨髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞において、いずれも同様であった（図１３（ａ））。ＴＡＸＩＳｃａｎ－ＦＬにより示されるＳＤＦ－１を加えた場合の遊走活性もまた、歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞と、骨髄および脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞において、いずれも同様であった（図１３（ｂ））。
［歯根に充填したＣＤ３１－ＳＰ細胞の皮下移植後の歯髄再生］
　次に、歯根に充填したＣＤ３１－ＳＰ細胞の、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスへのｉｎ　ｖｉｖｏ皮下移植を評価した。ブタ歯髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞移植後１４日には、十分に組織化された血管系を有する歯髄様組織が、根管に充填されていた（図１４（ａ）、（ｂ）、（ｃ））。ブタ骨髄ＣＤ３１－ＳＰ細胞移植によってもまた、毛細血管を有する歯髄様組織が誘導されていた（図１４（ｄ）、（ｅ）、（ｆ））。ブタ脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞移植の結果、石灰化が見られた（図１４（ｇ）、（ｈ）、（ｉ））。
［歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1－ＳＰ細胞の免疫原性］
　イヌ血液は、採血後直ちにベノジェクト真空採血管（ＴＥＲＵＭＯ）に移し同量の生理食塩水（大塚製薬）を加え転倒混和後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ　Ｔｕｂｅ（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）を用いて比重遠心法（比重１．００７）にて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離した。一方のＰＢＭＣを、抗原性を保持したまま増殖を抑制するため、マイトマイシンＣ　（ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）１０ｍｇ／ｍｌにて３時間３７℃にて処理しｓｔｉｍｕｌａｔｏｒとして使用した。
　イヌ歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の免疫調節能を比較するため、各細胞を１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭにて３日間培養後、それぞれの培養上清を採取し、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔｓ（ＭＩＬＬＩ　ＰＯＲＥ）を用いて１０倍に濃縮し、使用した。それぞれのＰＢＭＣを１×１０５ｃｅｌｌｓに調整後、ＰＢＭＣとｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ　ＰＢＭＣを１０％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０で９６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ上で４８時間共培養した。さらに、歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３１－ＳＰ細胞の培養上清をそれぞれ加えて、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒＯＮＥ（ＳＥＩＫＡＧＡＫＵ　ＢＩＯＢＵＳＩＮＥＳＳ　ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）（ＭＴＴ法）を用い、増殖活性を経時的に測定し、培養上清添加によるＰＢＭＣ増殖抑制効果を比較した。
　ブタ歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1－ＳＰ細胞の免疫原性に関与するｍＲＮＡをＲｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲにて検討した結果、ＭＨＣ（ｍａｊｏｒ　ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｐｉｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｍｐｌｅｘ）ｃｌａｓｓ　ＩＩＤＲＢ、ＣＤ８０、ＣＤ４０の発現は３種すべてで見られなかった。また、ブタ未分取のｔｏｔａｌ歯髄細胞と比べて、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＡ発現は歯髄０．０７、骨髄０．２５、脂肪０．０８で非常に低い発現だった。また、フローサイトメトリーの結果では、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩが３種とも陰性であり、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓＩは歯髄３６．０％、骨髄７３．８％．脂肪は８０．０％であった。よって、３種ともに免疫原性が低いことが示唆された。
［歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1－ＳＰ細胞の免疫調整能］
　イヌ歯髄・骨髄・脂肪ＣＤ３1－ＳＰ細胞の免疫調節能をｍｉｘｅｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ（ＭＬＲ）法にて、自己のイヌの末梢血単球の、他家の末梢血単球添加（これ自身増殖能なし）による増加を、３種の培養上清がそれぞれ抑制することにより検討した。その結果、歯髄・骨髄・脂肪ともにＣＤ３1－ＳＰ細胞は、自己の末梢血単球の増加を有意に抑制し、３種の間に有意差は認められなかった（図１５）。よって、３種とも同様の免疫調整能を有することが示唆された。
　１００　対象となる歯
　１１０　根尖性歯周炎
　１２０　歯根部分
　２００　根管充填材
　２１０　細胞外基質
　２２０　間葉系幹細胞
　２３０　遊走因子
　４００　血管
　５００　象牙質
　６１０　ゼラチン
　６２０　レジン
　６３０　形態形成因子
　６４０　セメント
　７００　根管充填材が充填された歯根部分

Claims (13)

  1. 抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後、根管の根尖側に挿入される、歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞と、細胞外基質とを含んでなる根管充填材。
  2. 前記間葉系幹細胞が、骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞のいずれかである、請求項１に記載の根管充填材。
  3. 前記骨髄幹細胞、脂肪幹細胞、羊膜幹細胞もしくは臍帯血細胞が、ＳＰ細胞、ＣＤ３１陰性ＳＰ細胞、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２９陽性細胞、ＣＤ４４陽性細胞、ＣＤ７３陽性細胞、ＣＤ９０陽性細胞、ＣＤ１０５陽性細胞、ＣＤ３１陰性細胞、ＣＤ４５陰性細胞、ＭＨＣ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ陰性細胞、ＣＤ１５０陽性細胞、ＣＸＣＲ４陽性細胞、ＣＤ２７１陽性細胞、ＣＤ１３３陽性細胞、ＦＬＫ－１陽性細胞，ＣＤ１６６陽性細胞あるいはＶＥＧＦＲ２陽性細胞のうち少なくともいずれか一つを含む、請求項１記載の根管充填材。
  4. 前記根管充填材が、細胞遊走因子、細胞増殖因子及び神経栄養因子のうち少なくともいずれか一つを含む遊走因子をさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の歯根管充填材。
  5. 前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞が根管の根尖側に位置し、前記遊走因子が根管の歯冠側に位置する、請求項４に記載の歯根管充填材。
  6. 前記細胞遊走因子が、ＳＤＦ１、ＶＥＧＦ、ＧＣＳＦ、ＳＣＦ、ＭＭＰ３、Ｓｌｉｔ、ＧＭ－ＣＳＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つである、請求項４または５に記載の根管充填材。
  7. 前記細胞増殖因子が、ＩＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ及び血清のうち少なくともいずれか一つである、請求項４または５に記載の根管充填材。
  8. 前記神経栄養因子が、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ　Ｙ、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ３及び血清のうち少なくともいずれか一つである、請求項４または５に記載の根管充填材。
  9. 前記細胞外基質が、コラーゲン、人工プロテオグリカン、ゼラチン、ハイドロゲル、フィブリン、フォスフォホリン、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸、ヒアルロン酸、キチン、ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＧＡ、ＰＤＬＬＡ、ＰＣＬ、ハイドロキシアパタイト、β－ＴＣＰ、炭酸カルシウム、チタン及び金のうち少なくともいずれか一つを含む生体親和性材料から構成されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の根管充填材。
  10. 前記細胞外基質における前記歯髄幹細胞を除く間葉系幹細胞の含有率は、１×１０３セル／μｌ以上１×１０６セル／μｌ以下である、請求項１～９のいずれか1項に記載の根管充填材。
  11. 抜髄後又は感染根管の根管拡大清掃後の根管の根尖側に、請求項１～１０のいずれかに記載の根管充填材を注入する工程を含む、歯組織再生方法。
  12. 前記根管充填材を前記根管の根尖側に注入する工程の前に、前記根管を拡大することで根尖部の根管の太さを所定の大きさにする工程をさらに含む、請求項１１に記載の歯組織再生方法。
  13. 第１の個体の歯の抜髄を行う工程と、
    　前記歯の歯根部分を所定の長さに切り出す工程と、
    　抜髄後の根管の一端を封鎖する工程と、
    　前記根管に、間葉系幹細胞と、細胞外基質とを含んでなる根管充填材を注入する工程と、
    　充填材を注入した歯根を第２の個体に移植する工程と
    を含む歯組織の異所再生方法。
PCT/JP2012/052155 2011-02-28 2012-01-31 間葉系幹細胞を含んでなる根管充填材、及びこれを用いた歯組織再生方法 WO2012117793A1 (ja)

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